慢速程序化冷冻对家兔卵巢组织形态学、ER、 PR 、Ki67和bcl-2影响的研究分析.docVIP

精品论文 参考文献 慢速程序化冷冻对家兔卵巢组织形态学、ER、 PR 、Ki67和bcl-2影响的研究分析 毕晓英 孙丽君 王丹丹 （河南中医学院三附院生殖中心 450008） 【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）09-0197-01 1 材料与方法 1.1材料 ①实验动物 选择8只4-5月龄、体重2-2.5kg健康雌性日本大耳白家兔，由河南中医学院实验动物中心提供。②主要试剂 丙二醇（PROH）、蔗糖（S）、磷酸盐缓冲液（PBS）、earlrsquo;s平衡液（EBSS）、兔抗人ER多克隆抗体、鼠抗兔bcl-2多克隆抗体。③主要仪器 cl-8000程序冷冻仪、2406-2型CO2培养箱。 1.2方法 1.2.1分组及取材 空气栓塞处死动物后，采用下腹正中切口，取出卵巢组织，所有髓质用手术刀片刮除，后把其切成1～2times;1times;1㎜3的小块，随机取出2-3块在Bouin式液中固定作为新鲜对照组待用，其余组织块行慢速程序化冻存，8只家兔的卵巢组织块都随机分为新鲜组和冷冻组。1个月后每只家兔分别取2-3块卵巢组织块进行复苏，复苏后在CO2培养箱中静止30min, 然后在Bouin式液中固定后待行组织学分析。 1.2.2冷冻及复苏 冷冻：室温下将卵巢组织块在平衡液（1.5M PROH+0.1MS+10mg/mlMSA）中平衡90min，再快速装入0.5ml冷冻麦管中放到程序冷冻仪上，冷冻参照COOK[1]慢速程序化冷冻方法将组织块冷冻后投入液氮中冷冻保存。复温：取出组织块在室温中静置30s后投入37℃水浴中2-3min，分别在1.0MPROH、0.5MPROH梯度液中静置5min，PBS液漂洗3遍后将组织块移入含5%HAS的EBSS中并置于37℃5%CO2培养箱中待用。 1.2.3组织学检测 所有固定的组织块按实验室常规处理切片，部分切片行免疫组化染色分析，部分做苏木精-伊红（HE）染色。根据Hreinsson[2]标准将卵泡分为原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡。 卵巢组织中卵泡数目用chi;plusmn;SD表示，统计方法采用SPSS11.7统计软件行studyrsquo;s-t检验。 1.2.4免疫组化分析 主要步骤如下：①所有组织切片经烤片、脱蜡后再经3%H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶10min；②微波抗原热修复2分钟，加入一抗，4℃冰箱过夜；③PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min，加入生物素化二抗并在37℃下孵育15 min；④PBS缓冲液再次漂洗3次，每次5 min，加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育15 min；⑤PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min，DAB染色1～3 min；最后苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。 上述步骤中以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知ER、 PR 、Ki67和bcl-2抗原阳性表达的组织切片为阳性对照，其中至少有一个颗粒细胞被染色的卵泡即认为阳性。阳性细胞为镜下见细胞结构完整，胞浆或胞核内见棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景；阴性为胞浆或胞核内无棕黄色颗粒沉着或与背景色一致。根据颗粒细胞和卵母细胞的染色情况将卵泡分为四个等级：（－；－）卵母细胞和颗粒细胞均未被染色；（－；＋）卵母细胞未被染色，颗粒细胞被染色；（＋；－）卵母细胞被染色，颗粒细胞未被染色；（＋；＋）卵母细胞和颗粒细胞均被染色。 2 结果 2.1组织学观察显示 与新鲜卵巢组织相比，冻融后卵巢组织内卵泡密度、各级卵泡比例以及卵泡大小均无显著性差异。 2.2免疫组化分析 新鲜组和冻融组卵泡的ER染色阴性率均为98%；新鲜组卵泡PR染色阴性率为96%，而冻存组为90%，两组卵泡内ER和PR表达无显著性差异，表明慢速程序化冷冻方法并未改变卵巢组织的抗原性。新鲜组细胞增殖抗原Ki67蛋白的阳性染色率为34%，冻融组为54%；而新鲜组抑制凋亡因子bcl-2蛋白的阳性染色率为75%,冻融组为78%，两者均无显著性差异。表明慢冻后快速复融的卵巢组织内各类细胞基本能够恢复生长增殖能力和正常的细胞周期，慢冻并未对其造成明显的影响。 3 讨论 在该研究中，我们发现新鲜组合冻融组卵泡密度并没有显著性差异，而不同家兔或同一家兔的不同卵巢组织片中的卵泡分别显示出了很大的差异，结果与Nisollle[10]等的研究结果相一致。这可能是因为卵巢基层中的