流感病毒NA基因联合鸡Mx基因制备抗病转基因鸡的研究Study on the preparation of disease resistant transgenic chicken with the NA gene of influenza virus combined with chicken Mx gene.pdfVIP

国家自然科学基金项目 The ect NaturalScience ProjSupported by Fundof China(No．3 0671 087179 509；No．3 1) 江苏省高校自然科学重大基础研究项目 (08KJA230001) 江苏省六大人才高峰基金 l ㈣幽 流感病毒NA基因联合鸡Mx基因制备抗病转基因鸡的研究 研究生：傅德智 导师：李碧春 专业：动物遗传育种与繁殖 (扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009) 中文摘要 NA在病毒的侵入和传播过程中起非常重要的作用。NA的主要作用是消除病毒颗粒表面及 感染细胞表面的唾液酸，对病毒粒子的释放以及防止病毒粒子的聚集很重要，既能够降解 流感病毒识别的宿主细胞上的受体一唾液酸残基；同时NA也具有免疫原性，其诱导机体 产生的特异性抗体可以对同种病毒的攻击提供完全保护，并可对同亚型不同病毒株的攻击 提供交叉保护。NA这一独特功能对防治禽流感病毒(AⅣ)具有重要的意义，使其成为国 内外抗禽流感病毒研究的热点之一。Mx(myxo．virus resistance)基因，即抗粘液病毒基因， 是由干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一，经I型(a／13)和Ⅲ型(九)干扰素、双股 RNA或病毒诱导可产生抗病毒Mx蛋白，具有独特的抗禽流感病毒作用。有研究表明鸡 Mx蛋白631位氨基酸多肽性与其抗病毒活性密切相关，当其为天冬酰胺时Mx蛋白有抗 病毒活性。本实验研究的目的在于尝试将被动诱导的Mx蛋白基因与可发生主动诱导免疫 的NA基因，分别单独构建表达载体以及构建Mx-NA双基因表达载体，比较NA基因、 Mx基因、Mx．NA联合基因表达产物的抗病效果。利用睾丸注射法将构建的上述双基因共 表达的重组载体导入体内生产转基因鸡，为培育抗禽流感转基因鸡开辟新途径。主要内容 如下： 1．NA基因和Mx基因的克隆、序列分析及重组真核双表达载体构建。设计合成NA基 Vector中，酶 狼山鸡Mx基因的cDNA。将NA基因和Mx基因扩增产物克隆至pMDl9．T 确。序列分析结果表明： II NA蛋白主要分布在细胞质及质膜附近，属于分泌型跨膜蛋白。 ②狼山鸡与肉鸡的Mx基因同源性最高，Mx蛋白为亲水性的非分泌型蛋白，主要分 布在细胞质中。 间接免疫荧光方法(m～)鉴定该联合蛋白在细胞中的表达情况。荧光倒置显微镜下观察， 功表达了重组Mx和NA蛋白。这为建立稳定表达细胞系及制备转基因鸡奠定基础。 Mx蛋白和NA蛋白的联合抗病毒作用，并且设立单基因抗病毒组，对各组实验数据进行 统计分析来研究各实验组抗病毒效果的差异；同时我们使用已制备的Mx和NA蛋白抗体 进行攻毒实验作为阳性对照。两种蛋白对新城疫病毒(NDV)感染的联合抑制能力显示：联 合应用Mx和NA蛋白可以有效的提高细胞对新城疫病毒的抵抗力，并且优于单基因的抗病 效果；两种抗体联合使用攻毒的实验结果也同时验证了这一结果。 4．睾丸注射法制备抗病转基因鸡的研究。采用脂质体转染法，将线性化的重组载体 精母鸡生产F 因在公鸡体内稳定整合的能力。结果表明，本实验中所使用的6只公鸡经PCR检测阳性率 为33．33％；F 1代血液基因组PCR阳性率达31．43％，Westernblot检