猪细小病毒PPVSC1株的分离鉴定(1)研究.pdfVIP

272 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 猪细小病毒(PPV)SOl株的分离鉴定 殷华平，罗燕，郭万柱*，徐志文 (四川农业大学动物生物技术中心，雅安四川，625014) 5 摘要：从四川部分猪场采集的流产、死胎中分离出了一株病毒．该病毒能够在ST、IBRS一2和PK一1 细胞上生长并引起明显的呈拉网状和细胞脱落的细胞病变。病毒能够凝集0．5鬈的豚鼠红细胞；荧光抗体染色 可见细胞内出现明显的荧光。电镜观察可见大4、约为22nm的无囊膜的病毒粒子。采用特异性PPVNSl基因 的引物得到了大小约为2．2kb的片段，经测序井经序列比较鉴定该病毒为猪细小病毒，命名为PPV-SCl。 关犍词：猪细小病毒；PPV-SCI；分离；鉴定 感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、胎儿术乃伊化及新生仔猪的死亡。本病最早发生于欧洲一些 国家，后发展到北美洲、亚洲、南美洲、非洲及太平洋洲…。现在世界许多国家和地区均有流行。张 代荣等(2002)对四川省部分种眚(猪)场共552份血清进行了猪细小病毒抗体检测，结果平均阳性率 为52％，最高可达93％。可见PPV在我国广泛地流行，对畜牧业的发展起着重要的影响．本文从四川部分 猪场采集到的流产、死胎中分离出了一株猪细小病毒，为今后进行猪细小病毒的诊断、预防和控制打 下了基础。 1材料与方法 1．1实验材料 供；豚鼠购于华西医大实验动物中心。 1．2实验方法 1．2．1 病料的处理按参考文献…无菌采取四川部分猪场初产母猪的流产胎儿、木乃伊胎的实质器官 心、肝、脾、肺、肾进行处理。 1．2．2病毒的分离培养处理好的病料在细胞传代的同时，或者待细胞长满细胞瓶的l，3后时，进行 接种，37％培养，观察3-6天，待细胞出现病变后，收冻。如3-6天后还未出现病变，再盲传3代， 若无病变则弃之。 1．2．3血凝及血凝抑制实验”1。 1．2．4免疫荧光实验“。进行免疫荧光的榆测，同时做阴性正常细胞对照。 1．2．5病毒的电镜观察”l。将细胞培养物用醋酸铀和柠檬酸铅染色后观察。 1．2 5’GTCGAATTCAGCATGGCAGCGGGAAAC TGGAT xbuffer 3’，预计扩增的片段大小约为2．2kb。PCR反应体系采用5叫l体系：10 P1(25／amol／1)2／al，P2(25pmol／1)却l，MgCl2(25mmoVl)3MI，模板59l，Taq 基金项目：刚川省科技厅应用基础项目(03JY029．035—2)资助。 作者简介：殷华平(1977．)，男，oaJII广安人，oⅡ／fl农业大学在滨博上，主要从事传染病病原分子生物学研究。 +通讯作者：郭万柱E_mail：wzguo@126．com 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 273 混匀后在PCR仪上反应：95℃10min；94℃30 min。 同时做正常的sT细胞DNA对照。将PcR产物直接送宝生物公司测序进行鉴定，并与PPVNADL-2《莆毒 的序列进行同源比较。 2结果与分析 2．1病毒的分离 睾丸传代细胞sT上传代后均能出现细胞病变(CPE)。接毒2_4天后可明显见到规律性的细胞病变 (CPE)：培养细胞出现弥散性颗粒，胞浆收缩，细胞变圆，有的细胞m现细胞间的融合、聚集现象或者 呈拉刚状，最后病变细胞开始崩解脱落，出观空斑(病变如图1A、B、C)。 A B C 图1：感染PPV—SCl的PKl5(A)、IBRS-2lB)和ST(C】细胞 PKl5(A)、IBRs一2(B)和sT(c)cdllines Fig．1 ppv—