猪圆环病毒2型分子标记毒株的构建及生物学特性研讨.pdfVIP

猪传染病 源性为99．4％．Cap蛋白的同源性较低，表明这两株毒株的Cap蛋白变异较大。与国内外分离 09397，AF055391，AF055392，AF055393，AFl09398，AFl17753，AFl66528， 掰(AF086836，AFl 两株病毒在ORF2基因上已发生了较大的变异。 由系统进化树图分析可以看出该分离株与与AYl81945GD和AF055393U．K．关系较近， TJ和AYl22275 处于同一分支；而与国内分离株AYl81946 HEB关系较远，与美国和加拿 大的分离株关系较远。山东的猪圆环病毒2型是否是由从欧洲国家引种时引入，还需进一步 研究。 参考文献略 猪圆环病毒2型分子标记毒株的构建及生物学特性研究 刘长明，危艳武，张超范，陆月华，孔宪刚 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001) 摘要以临床分离的猪圆环病毒2型(PCV2)为材料，利用PCR法扩增病毒基因组，将2个基因组顺式连 接插入到质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基，在病毒基因组内插)LSalI制性内切酶位 点作为遗传标记，经重组质粒转染细胞获得带有遗传标记的新毒株．采用免疫过氧化物酶单层细胞试验、 免疫电镜，核酸序列分析表明，在病毒感染细胞中检出病毒特异抗原，其抗原性、病毒形态学及基因序列 与亲本毒株一致．鉴于新病毒基因组内插入一个SalI酶切位点，可用限制性片断长度多态性分析法可与野生 型病毒相鉴别．新毒株经细胞连续传80代，体外培养增殖性能稳定，毒价可达107．0TCID50／m1．取第60 代病毒培养物经肌肉和滴鼻途径接种35日龄抗体阴性仔猪4头，接种后表现出体温升高、进行性消瘦、被毛 粗糙及体表淋巴结肿胀症状，迫杀后多种脏器中均能检测到病毒抗原与核酸．研究表明，利用感染性分子 克隆手段构建带有遗传标记的PCV2新毒株，为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、分子诊断等研究奠 定了基础． 关键词猪圆环病毒2型；遗传标记病毒；生物学特性 猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合症 type (Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)。本病于1997年在加拿大首次证实， 相继欧、美、皿各洲许多国家均有本病发生的报道【I，2J。我国猪群也普遍有本病流行，对养 猪业构成巨大危害。除PMWS外，猪皮炎与肾炎综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道综 合征、繁殖障碍、先天性颤抖、胎儿心肌炎及肠炎等疾病也证实与PCV2感染有关。PCV2 是一种圆形小颗粒病毒，直径17nm，呈二十面体对称，无囊膜，基因组由单股负链闭环DNA 体免疫系统相互作用有关，可导致全身性淋巴细胞坏死，引起淋巴细胞耗损和巨噬细胞减少， 引发机体免疫抑制，增加对各种病原体的易感性【11。本研究以临床PMWS病猪分离的PCV2 野生型毒株为材料，采用基因工程技术构建病毒基因组感染性分子克隆，通过引物设计替换 碱基的方式，构建带有遗传标记的新毒株，可利用PCR与限制片段长度多态性分析法与野 生型病毒相鉴别。构建的新毒株为本病毒的致病性、致病机理、疫苗免疫及分子诊断等研究 开辟了新途径。 l材料和方法 1．1病毒、细胞、抗体、菌株及载体 人事部高层次留学人才回国工作资助项目 作者简介：刘长明(1961一)，男，吉林乾安人，博士，研究员，博士生导师，主要从事猪病研究， Tel：0451一E-mail：1cm国hvri．ac．cn ．．226．． 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 抗体效价为3200倍，用于病毒抗原检测；基因克隆所用的大肠杆菌株(Topl0)、载体(pUCl9) 猪肾传代细胞系(PKl5)由国外引进。 1．2引物设计与PCR扩增 引物参考GenBankAF201311序列设计。命名为 下划线处斜体字母表示替换的碱基，构成Sail酶切位点。病毒DNA按文献【5】方法提取， TaKaRa ExTaq 72℃1．5rainl，延伸反应72℃7rain。P