实验室细胞培养规程汇报.pptxVIP

细胞培养汇报;原代培养 传代培养 胰蛋白酶处理分离细胞 细胞的冻存 冻存细胞的复苏 MTT法检测细胞活力 常见的细胞染色法 ;一、原代培养;组织块培养; 养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块置温箱中静止培养 待细胞从组织块游出量增后，再补加培养液 ;分散细胞培养;消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，液体变酸，用NaHCO3调整。 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 ;二、传代培养;悬浮型细胞的传代培养;在新的培养容器内加入步骤3计算出的所需添加的新鲜培养基及细胞悬液。如有必要，可在培养容器内充满无菌过滤的CO2，封好培养容器并置于合适的温度下孵育培养。 通常情况下，换液时不需要每次都完全更换成新的培养基，除非细胞密度非常高或者是培养基的pH偏酸性（培养基颜色偏黄）。如需完全更换培养液，将细胞悬液在125g离心力下离心10?min，吸弃旧培养基，然后使用新鲜培养基重悬细胞。 ;单层细胞的传代培养;三、胰蛋白酶处理分离细胞;单层细胞的胰蛋白酶处理;;胰蛋白酶/EDTA 10x储存液 胰蛋白酶（1:250） 5.0g EDTA?四钠盐 2.0g NaCl 0.85g H2O 100ml 胰蛋白酶1x工作液（0.05%） 胰蛋白酶/EDTA 10x储存液 100ml NaCl 7.1g KCl 0.4g 葡萄糖 1.0g NaHCO3 0.35g 1%酚红 1.0ml H2O 900ml ;四、细胞的冻存;;吸干已长满细胞的细胞懂得内培养瓶 加2ml胰蛋白酶处理细胞 让液体在细胞表面来回流动4-5次 吸干胰蛋白酶液 重复步骤3和4 置37℃3-5分钟 将细胞从细胞培养瓶表面洗下，重悬细胞于3-5ml培养液中;离心，200g，5分钟；重悬沉淀于1ml冻存液中 加入1ml细胞（单层细胞约3x106-5x106；悬浮细胞约为5x106-10x106 ）于冻存管上标明细胞系的名称、日期和生长培养液 置冻存管于细胞冻存器中，并让细胞冻存管在-80℃过夜或利用可控速率的冷冻装置 次日，将冻存管移至液氮中。此步骤操作宜迅速，冻存液不应融化;冻存液;五、细胞的冻复苏;调整水龙头温度为40℃，在龙头下放置一广口烧杯 从液氮中取出冻存细胞的冻存管 将冻存管置于40℃流水中直至完全融化，一旦冰块消失即将冻存管从水浴中取出 用70%乙醇擦洗冻存管外部以降低污染机会 吸取冻存管内容物于T-25细胞培养瓶或培养皿中，缓慢加入4ml生长培养液，并混匀 37℃孵育细胞，在24小时内更换培养液以滋养细胞;六、MTT法检测细胞活力;;普通MTT法实验步骤;;药物MTT法—贴壁细胞;;;药物MTT法—悬浮细胞;;同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 ;注意事项;MTT对菌很敏感，保持无菌环境 选择适当得细胞接种浓度，每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异 铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致，一般每加几孔就混匀一下 保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间;检测方法;七、常见的细胞染色法;瑞氏染色法:瑞氏染料溶剂主要是由伊红美蓝组成 细胞免疫荧光染色法: