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奶牛乳中体细胞DNA染色方法的研究 冯万宇 周庆民 徐馨 张艳 宁秀云 黑龙江省兽医科学研究所 讷河市动物防疫站 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 摘????要： 以甲基绿为染色剂, 研究其对奶牛乳中体细胞DNA的染色效果, 建立一种牛乳体细胞DNA染色方法, 结果表明:随着牛乳中体细胞数的增加, DNA含量也随之增加, 经甲基绿处理的DNA颜色逐渐加深, 这为利用甲基绿进行DNA染色分析牛乳体细胞数和奶牛隐性乳房炎诊断提供了科学依据, 为奶牛隐性乳房炎的诊断、判断预后及其监测提供了一种新方法和途径。 关键词： 甲基绿; 体细胞DNA; 奶牛; 隐性乳房炎; 作者简介：冯万宇 (1976-) , 男, 黑龙江省木兰县人, 硕士, 副研究员, 主要从事奶牛普通病防治研究工作。 收稿日期：2017-06-05 Received： 2017-06-05 隐性乳房炎一直是影响奶牛业发展的瓶颈之一, 发病奶牛无临床发病表现, 其指征主要是发病奶牛泌乳量不同程度下降, 乳中体细胞总数升高, 乳中的主要成分乳脂、乳蛋白、乳糖含量均有不同程度地下降, 乳质差, 出现劣质乳和废弃乳, 如果管理不当病情加重, 极易转化为临床型乳房炎, 治疗和管理费用会大幅度增加, 乳中出现抗生素等药物残留, 既产生了药残奶, 也会因用药后的休药期使有效产奶量显著减少, 若治疗无效则会造成奶牛淘汰, 严重危害奶牛业的健康发展。 对隐性乳房炎控制最有效的手段是早发现早治疗, 使隐性乳房炎奶牛尽早转归为正常健康奶牛, 国内外监测隐性乳房炎是通用乳中体细胞计数, 根据每毫升乳中体细胞总数的不同设置判断隐性乳房炎的最低阈值, 直接显微镜计数无疑是计算体细胞数最准确的方法, 但耗时长, 操作复杂, 需要特定的仪器和有经验的专业人员操作才能减少误差[1]。 加州奶牛乳房炎试验 (CMT) 是国际通用的诊断隐性乳房炎的方法, 在此基础上衍生出WMT、PL、BMT、HMT等一系列类似的方法, 这些方法都具有简单方便、快速、敏感的优点, 但最大不足在于其所提供的仅仅是体细胞的一个相对数量, 结果严重依赖于检测者的经验, 易出现假阳性。Urbanova应用吲哚裂解牛乳体细胞, 经分光光度计检测DNA含量证实, 牛乳体细胞数量与其中的DNA含量成正比, DNA测定法比CMT、WMT等方法精确性更高, 但由于以往DNA分离过程复杂, 检测繁琐, 难以在奶牛场和乳品检验中心大规模推广应用[2]。 甲基绿是一种常见的染料, 在水溶液状态下与DNA结合后显示绿色, 是DNA鉴定常用的一种方法。本研究在前期牛乳体细胞裂解的基础上, 以甲基绿为染色液, 研究甲基绿对经碘化钾裂解后不同浓度牛乳体细胞DNA染色效果, 以期为应用甲基绿染色法诊断奶牛隐性乳房炎提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 试验材料 乳样来自齐齐哈尔郊区某规模化标准奶牛场, 日粮为TMR全混合日粮, 以全程机械榨乳方式挤乳, 每日3次。 1.2 试验试剂 试验中所用到的主要试剂包括0.2 mol/L PBS, 5 mol/L碘化钾, 2%甲基绿, 二甲苯, 美兰乙醇饱和溶液, 95%乙醇等。 1.3 试验仪器 台式离心机;生物显微镜;生物分光光度计;载玻片;微量移液器和100μL、200μL枪头若干。 1.4 试验方法 1.4.1 奶样采集 试验奶牛乳房用温水清洗后, 用一次性纸巾擦干, 手工挤出前三把乳后弃去, 随即开始采样, 冰盒低温冷藏后迅速送至实验室检测。 1.4.2 奶样检测 将新鲜乳样充分摇匀, 用微量移液器吸取中部乳汁10μL, 滴于载玻片一端中侧, 仔细涂布成约1cm面积的乳膜, 37℃温箱干燥, 然后用二甲苯脱脂5 min, 再置于95%乙醇中固定5~10 min。干燥后, 用美蓝染色液染色5 min。水洗, 再用95%乙醇脱色数分钟, 水洗干燥后镜检。在生物显微镜油镜下观察, 计100个视野内的细胞数, 对体细胞数高于10万个/m L以上者留样进行如下试验。 1.4.3 乳样体细胞DNA染色 取乳样5 m L, 4℃3 000 r/min离心10 min, 弃去脂肪层和脱脂乳层, 以乙醇脱脂棉球拭去离心管内壁上的乳脂, 加入PBS至5 m L, 4℃3 000r/min离心10 min, 吸取上清液弃去, 加入PBS混匀至5 m L。用微量移液器取混匀的体细胞悬液100μL至2 m L试管中, 随后加入5 mo1/L碘化钾溶液100μL混匀, 2 min后加入2%甲基绿溶液200μL, 混匀3 min后观察试管内颜色变化。 2 试验结果 2.1 碘化钾对牛乳体细胞的裂解效果 碘化钾对