死亡受体6相互作用蛋白质的筛选与鉴定研究.pdfVIP

死亡受体6相互作用蛋白质的筛选与鉴定 王梁华，罗以勤，李茂，高云，球谊，孙铭娟，张兴群，倪健，焦炳华2 (第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，上海200433) 及细胞的多种行为，与机体的生理和病理过程密切相关n卫1。截止目前，至少对19种配体和29种受体进 有报道伸’耵。本研究通过所建立的细菌双杂交系统筛选得到了可能与DR6相互作用的分子，对其中的丝氨 酸蛋白酶抑制剂家族分maspin进行了重组表达，并用胺化磁珠法分析了与DR6的结合。这些结果表明： 丝氨酸蛋白酶抑制剂家族可能为DR6相互作用蛋白。本工作为进一步阐明DR6的结构与功能打下了基础。 一、材料和方法 (一)试剂 BacterioMatch Stratagene two-hybridsystem，所带质粒由本室扩增保存，菌种传代保存。pMAL 表达与纯化系统，NEB公司产品。质粒由本室扩增保存。 各种抗生素、常用生化试剂购自北京鼎国生物技术发展中心和上海生工生物工程公司，工具酶(T4 DNA连接酶、限制性内切酶、Taq酶等)购自TaKaRa公司。 (二)引物与测序 DR6细胞外区域以PCR从pCM＼rFlag—DR6一Ec驴Fc上扩增，引物如下：P1： ；DR6插 引 物P5： 5’一ggaagcttaaggagaacagaatttg-3’入pMAL_c2 素的LB管中扩增过夜，取菌液直接送上海华诺进行全自动荧光测序。 (三)Statagcno人肝细胞eDNA文库的扩增 u ml cm p 取lO l原始菌液用60 SOC培养基稀释，铺于200块15LB-TK平皿，300l／块，涂匀。 30℃培养30h后，刮下所长出的细菌，回收于在冰上预冷的SOC培养基的离心管中；SOC培养基再洗LB—TK 平皿，回收细菌。以质粒大抽试剂盒抽提质粒(上海华舜)。 (四)共转化 与文库质粒各10ng共转化于XL-IBlue感受态细胞，加入终浓度为25mmol／L的B一巯基乙醇作为转 含X-gal-IPTG或PETG的TCK平皿上进一步验证后进行插入片段的序列分析． 【五)DR6、maspin的重组表达与纯化 · 124· 毗IPTG诱导表达一表达产物用试剂盒所带的直链淀粉亲和层析柱初步纯化，括性X因子酶切，分离得到 MBP、nR6，maspin重组蛋白。 (六)胺化(NHz—terminated)磁珠分析蛋白的结合 将重组袭逃的0R6、masoi n、MBP共价结合在磁珠上。以下式测定结台效率： 术缩台前溶液吸光值×稀释倍数]一(结合后溶液的吸光值×稀释倍数 结台敛率 未结合前溶液吸光值 二、结某 (一)构建pBT—DR6，与肝细胞eDNA共转化 经酶切鉴定f图1)与序列分析。根据Ⅻ4序结果所读得舶序列与预期的致。 图1酶切鉴定pBT—DR6EGD—Fc Ff I Identificationofrecombinant g EcoRI and PIasmidsby BamH M GeneRuler100 I)NAladder bp plus。 1 Fcdi wlth 2：pBT—DR6ECDgested EcoR【andBamllI 然后与Stratagene人肝细胞cDNA文库扩增后所抽提的质粒．备IOB1ue ng共转化XL—l MRF，铺 1砷0LL☆m]C的I．B CTCK平皿上。重复筛选了8轮敬，共计360余块15