重组水蛭素Ⅲ的分离纯化和鉴定研究.pdfVIP

研究论文综述 2004年全田生物技术学术研讨会论文集 重组水蛭素ⅡI的分离纯化和鉴定 韦利军1 昊斌2李雪峰1叶双宁1章良1昊梧桐 (1中国药科大学生命科学与技术学院；2常州千红生化制药公司) 摘要：对大肠杆菌生产的重组水蛭素lll发酵液进行三个步骤的纯化，选出最佳分离纯化条 件。首先将分泌到培养基上清液中的水蛭素进行大孔吸附树脂层析，再用DEAE纤维素离子交 换层析分离，最后用制备型反相高效液相色谱层析，经真空冷冻干燥得到水蛭素成品。对收集 液进行SDS．PAGE分析，各步纯化产物均达到电泳纯】oo％；经分析型反相高效液相色谱分析， 成品纯度大于反相纯95％：经质谱鉴定，成品分子量约为6920，确为重组水蛭素llI。 关t词。水蛭素，分离，纯化，大孔吸附树脂，反相高效液相色谱，质谱 水蛭素是蛭类动物唾液腺分泌的一种酸性多肽。人类利用水蛭治病的历史可追溯到远古时 代。基因重组水蛭素(RecombinantHirudin)是天然水蛭素的基因重组产物，但在酪63无硫酸 基，故亦称为去硫酸水蛭素。重组水蛭素和天然水蛭素一样，是典型的抗凝血酶药。水蛭素存 血水蛭的水蛭素含量极少，从水蛭中大量提取水蛭素是不可能的。生物技术的飞速发展，为大 量生产水蛭素开辟了广阔的前景。HV3的氨基酸序列如下所示： 在大肠杆菌中分泌表达f41。本文试图摸索出重组水蛭素III的分离纯化优化组合与条件，并对纯 化产物进行鉴定。 l材料与方法 1,1材料 美国Whatman的DEAE．cellulose DE52；美国Tedia公司产色谱纯乙腈；其它试剂为分析纯。 AKTA 15 Explore喇液相色谱仪。反相柱RESOURCE HPLC。 MS／MS型质谱仪。 Q．TOFmicroTM 1．2抗凝血奠活力的测定 内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。由 于水蛭素与凝血酶是1：1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于～个抗凝血酶单位(ATU)。 1．3大孔树脂层析分离纯化 1．3．1静态吸附实验 l¨ 2004年全国生物技术学术研讨会论文集 研究论文综述 上清中抗凝血酶活力， 计算每种树脂一定时间内的吸附率。 吸附率 E(％)=旦等}×1 00％。式中c。，c分别为吸附前后单位体积内的抗凝活力 (ATU／m1)。 恒温摇床振荡(120rpm)，每30min取上清O．5min离心测活，选择最佳pH值。 1．3．2动态吸附实验 一定体积的发酵液上10ml湿树脂柱，用恒流泵调节流速，流出液出现抗凝血酶活力即停止 酵液初体积，v2表示发酵液终体积，A表示发酵液的抗凝血酶活力，V表示湿树脂的体积。 30min测定吸附率(％)，绘制动态吸附曲线。 1．3．3解析与洗脱 值，以lml／min的流速，将样品上柱。用酸(20mmol／L乙酸)、碱(50mmoi／Ltris／HCl)清洗， 采用不同的溶液作为洗脱剂进行洗脱，收集活性组分，测定洗脱曲线，并计算回收率。 1．4离子交换纤维素层析分离纯化 10ml DEAE．cellulose 溶液梯度洗脱，收集活性组分。 1．5制各型反相高效液相色谱分离纯化 选择不同组分作为流动相【6’7l，于相同条件下在液相色谱仪上进行反相高效液相层析。条件 如下： in 1)A液0．1％(v／v)FTAinl00％(％)水；B液0．1％(v／v)FTA100％(v／v)异丙醇。2) A液0．1％(v／v)FTAin in 100％(％)水；B液0．1％(v／v)FTA 15RPC，柱温为室温，流速2ml／min，洗脱梯度：0．100％异丙醇，15-50％乙腈。 1．6重组水蛭素Ⅲ的分离纯化组合实验 采用优化后的分离纯化条件对水蛭素Ill发酵液进行放大分离纯化实验。大孔