水稻osRACD基因的转基因功能鉴定及其下游互作蛋白编码基因的分离研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 光周期敏感核不育水稻农垦58S(PGMR)，是石明松先生于1973年在晚粳水 稻农垦58N的大田中发现的自然突变体，其育性由隐性核基因控制，基因表达受 光周期调节，具有在长日照高积温环境条件下导致花粉粒不育，在短日照低积温 环境条件下恢复花粉粒可育的光周期育性转换遗传特性。有关光敏核不育水稻农 垦58S的细胞学，生理生化，遗传育种以及基因定位的研究工作，已取得了丰硕 的成果。光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换分子机理的研究及其相关基因 的克隆，具有重大的理论意义和潜在的生产应用价值。 本研究利用植物的遗传转化和基因工程等技术，对水稻低分子量GTP结合蛋 白的编码基因 S‘RACD进行了一系列的研究，取得了如下主要结果:(1)对水稻 的遗传转化体系进行了改良，发展出一种适合农垦58N及58S的转基因体系;(2) 构建了反义和正义osRACD基因的表达载体;(3)应用转基因技术证实osRACD基 因与农垦58N水稻和拟南芥植株的育性存在着直接的相关性;(4)花粉离体萌发 证实外源转入反义osRACD基因的表达可以阻断拟南芥花粉管的生长延伸;(5) 在裂殖酵母sPQ01中超量表达osRACD基因，进一步证实osRACD基因参与调控极 化细胞的生长;(6)获得了转正义osRACD基因的农垦58S水稻植株，并对这些 长日照条件下生长的转基因58S植株花粉和种子育性进行了分析，证实我们实验 室分离的osRACD基因与光敏核不育水稻农垦58S的光周期育性转换性状之间存 在着一定的相关性，是一种重要的光周期育性转换发育调节基因;(7)利用酵母 双杂交从农垦 58N水稻的幼穗表达文库中筛选得到一个细胞骨架蛋白编码基因 osRIDl和另一未知基因。sgID2;(8)对 s‘RI111进行了表达模式分析。 1构建反义 “RACD基因表达载体pWMASD。以光敏核不育水稻农垦58S的 野生型，农垦58N为材料，建立起有效的水稻遗传转化体系。利用分子生物学技 术，对再生植株进行PCR和Southern杂交检测，获得大量的转反义osRACD基因 58N植株。反义。sRACD基因的表达降低了转基因58N水稻幼穗中osRACD基因的 表达水平，并且显著降低转基因58N水稻的育性，有76.7%的转基因植株的结实 率低于10%，但其花粉的育性却没有明显下降。 2.反义osRACD基因在拟南芥植株中的表达导致其育性下降，花粉离体萌发 实验表明，对照植株的花粉能够正常萌发和生长，而转反义osRACD基因拟南芥 植株的花粉则有的不能萌发，有的萌发后其花粉管的生长延伸过程受阻。因此而 导致转基因植株的育性下降。而且，osRACD基因在裂殖酵母中的超表达导致正 常的胶囊状酵母细胞变成圆而小的细胞。这说明，osRACD基因在调控极化细胞 的生长延伸过程中起着重要作用，是花粉萌发后花粉管生长中不可缺少的因子。 3.将获得的转正义osgACD基因58S水稻植株都栽种于长日照条件下。RT-PCR 和Northern杂交结果证实，转入的正义。SRACD基因在转基因58S水稻植株中都 中文摘要 得到了稳定的表达。正义osRACD基因在58S水稻中的表达，使长日照下生长的 转基因58S水稻植株的育性均得到不同程度的恢复，有的转基因58S水稻植株的 结实率还高于58S-SD对照植株。转正义osRACD基因58S水稻植株的结实率以及 花粉活性分析表明，osRACD基因参与了光敏核不育水稻农垦58S对光周期反应 的调控过程。 4构建以osRACD蛋白作为诱饵的诱饵质粒表达载体pBD-D。利用酵母双杂 交，来筛选农垦58N水稻幼穗中与诱饵蛋白osRACD相互作用的蛋白质的编码基 因。得到两类阳性克隆，其中之一为编码肌球蛋白重链样蛋白基因的部分 。DNA 序列，命名为。sRIDI，另一类则是一个与osRID1有部分同源的未知基因，命名 为osRID2。对这两个基因进行原核表达，二者分别编码一大约45KD和55KD的 多肤。osRID1的表达模式与OSRACD一样，在光敏核不育水稻中的表达也受光周 期调控，仅在可育的水稻幼穗中表达，而在不育的幼穗中不表达，在水稻的根和 叶中也均未检测到其转录物。而且，反义osRACD基因在农垦58N水稻中的表达， 同样降低了osRID1的表达水平;正义osRACD基因在长日