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细胞中eIF-5A定位的方法研究 项目完成单位：国家生物医学分析中心 项目完成人：周涛 靳宝锋 杨怡 李慧艳 张飒 张德添 张学敏 一、立题依据 细胞凋亡的机制是目前研究的热点问题之一，我们应用蛋白质组学技术初步进行了细胞凋亡相关机制的研究。以对阻断泛素-蛋白酶体通路(简称UPS通路)极为敏感的白血病细胞系M-07e为模型，用泛素-蛋白酶体通路特异阻断剂Z-TL-CHO诱导细胞凋亡，发现细胞凋亡前后双向电泳上T蛋白点的表达量显著增加，经生物质谱鉴定T蛋白点就是eIF-5A。这说明M-07e细胞凋亡过程中，eIF-5A被诱导表达，可能参与了细胞凋亡的信号转导过程。那么，被诱导表达的过量的eIF-5A定位在细胞的什么位置？在细胞凋亡的过程中定位有无变化？如有，是如何变化的？总量上又是如何变化的?这都是需要解决的问题。 eIF-5A的亚细胞定位虽有报道，但结果不一致，相互冲突。如：Ruhl M等认为eIF-5A定位于细胞核， Rosorius O等人则进一步精确定位至细胞核的核孔复合物上，shi XP等认为eIF-5A主要定位于细胞质中，而Jao 和 Chen等则认为eIF-5A为全细胞分布。因为蛋白质的定位信息将为其功能的研究提供重要线索，因此我们同时采用了间接免疫荧光、荧光蛋白标记等方法进行eIF-5A亚细胞定位的研究。 解决蛋白定位的问题，比较常用的是间接免疫荧光标记和免疫胶体金技术，近年来发展了利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。间接免疫荧光标记技术因为是在光镜水平进行研究，因此无法进行精确的亚细胞定位。而免疫胶体金技术则因为制样过程繁琐复杂，非特异性标记较高，且重复性差。利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，但仍是在光镜水平进行研究，只是不需要制样，没有非特异性标记的影响。并且GFP的分子量为27kD，eIF-5A的分子量为16～18kD，若利用GFP来定位，是否对eIF-5A的定位有干扰还不清楚，因此我们必须寻找更好的定位分析方法。 最近，美国圣迭哥大学Griffin, BA等合成了一种有机砷的化合物FlAsH，与特定的能形成α-螺旋的含4个半胱氨酸残基的肽段结合后，可发射荧光。这种肽段一般只需要十几个氨基酸残基，但其核心区域必须是-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-。此外其衍生物中可发红色荧光的ReAsH相对于FlAsH来说，还有另外一个特点，即在有氧情况下，可对二氨基联苯(DAB)发生光转化反应，经激光扫描共聚集显微镜高强度激光照射后，可产生一种电镜下可观察的褐色产物，从而将激光扫描共聚焦显微镜与电镜有机地结合起来，对蛋白质进行精确定位。利用FlAsH和ReAsH可发射不同颜色荧光，又都是与同样的肽段相结合的特点，可以在不同的时相对细胞内该蛋白进行脉冲追踪，实现对蛋白生命周期的观察。 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。 二、主要研究内容 1．真核表达载体的构建 ①引物设计 利用引物设计软件，根据FlAsH试剂所需的结构，选定肽段Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala，根据此肽段并按照所需构建的载体酶切位点的要求，设计如下引物： 1．TCGAGGCTGAGGCTGCCGCCCGCGAGGCTTGCTGCCGCGAGTGCTGTGCCAGG 2．CCGACTCCGACGGCGGGCGCTCCGCACGACGGCGCTCACGACACGGTCC GCCTAATGAT CGGATTACTAGATC 这1对序列通过计算机模拟检索，引物自身无发卡结构，且引物之间不形成二聚体。其中上游 TCGAG 为XhoI 酶切位点，下游 T 为XbaI C AGATC 酶切位点。 ②载体构建 将以上合成引物退火后装入pcDNA3.0载体的相应酶切位点，并将pEGFP-N1/eIF-5A用BamHI 和 HindIII 进行双酶切，把BamHI-eIF-5A- HindIII 片段连入已构建好pcDNA3.0/FlAsH，得到表达eIF-5A- FlAsH肽段融合蛋白质的真核表达载体。 2．免疫荧光检测COS-7和HEK293细胞，用PBS洗3遍。4%多聚甲醛固定4℃ 30 min，PBS洗3遍。0.2%Triton X-100-PBS