香蕉条斑病毒ORF Ⅰ、ORF Ⅱ酵母双杂交系统诱饵质粒的构建及鉴定.pdfVIP

2011年 6月 热 带 农 业 科 学 第 31卷第 6期 June．2011 CHINESE JOURNALOFTROPICALAGRICUIJTURE Vo1．31，No．6 香蕉条斑病毒ORFI、ORF11酵母双杂交 系统诱饵质粒的构建及鉴定① 林湛松 )② 王小明 龚 殿 刘志昕 ③ (1海南大学环境与植物保护学院 海南儋州 571737： 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所 ＼ 农业部热带作物生物技术重点开放 实验 室 海南海 口 571101) 摘 要 以连接在 pMD一18T载体上 的香蕉条斑病毒 (BSV)全基 因组为模板 ．PCR扩增得到了带有 Gateway⑧重组 反应接头序列的香蕉条斑病毒 ORFI及 ORFII基因片段 ，经过 BP、LR重组后 ，构建成带有 目的片段 的酵母双 杂诱饵质粒 pDEST32—01及 pDEST32—02 将质粒转化 EcoliDH5 感受态细胞 ．筛选序列和编码框均正确 的重组 质粒 将 以上 2种正确的重组质粒分别与用于构建诱饵质粒 的pDEST22空质粒共转化酵母 MaV203感受态细胞 ． 利用营养缺陷培养基 (SC—Leu—Trp)筛选转化子 。并对转化子进行毒性鉴定 、自激活鉴定 以及 3一AT抑制浓度鉴 定 。结果显示 ，2种转化子均生长正常，说 明所构建的2个重组质粒表达蛋 白对酵母无毒性作用 ，其在特异营 养缺 陷培养基 (SC-Leu-Trp—Ura)中无法生长 。不能产生 自激活现象 ．3-AT抑制浓度分别为 5O、75mmol／L。以上 结果说 明所构建 的2种诱饵质粒均可用于后续酵母双杂工作 ．为 BSV与宿主的蛋白互作奠定了基础 关键词 香蕉条斑病毒 ；酵母双杂交 ；诱饵质粒 ；自激活鉴定 分类号 Q503：Q939．4 Construction and TestoftheBaitPlasmid ofORF I， ORFH ofBanana Streak Virusin theYeastTwo--hybrid System L。N Zhansong’’ WANG Xiaoming’ GONG Dian’ LIU Zhixin (1CollegeofEnvironmentandPlantProtection，HainanUniversity，Danzhou，Hainan571737； 2 Ministry ofAgriculture Key Laboratory ofTropicalCrop Biotechnology， InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology，CATAS，Haikou，571101) Abstract In thepresentstudy，thetwotargetsegmentscontainingtheGatewayrecombinantsequences werefirstlygeneratedbywt oPCR amplifications，respectively，usingthewholegenomeofBSV—Yunnan asthetemplate．Thenhtewt o recombinantplasm idspDEST32一O1andpDEST32·02weregeneratedby wt o stepsofGateway recombination reactions，BP and LR respectively．Thewt o plasmidswere then ~ansofrmedintothecompetentcellsofE．coliDH5a ，theplasmidswithbothaccuratesequencesandthe