马立克氏病病毒pp38基因上游的一个双向启动子研究.pdfVIP

‘14 of 2．ProceedingsSymposium of VeterinaryMicroorganism Branch—,Chin—eseAsso—ciation Mi～croorganisms 马立克氏病病毒pp38基因上游的一个双向启动子+ 丁家波，崔治中“，孙淑红，姜世金 (山东农业大学动物科技学院，泰安271018) [摘 要] 马立克氏病病毒(MDV)基因组DNA复制原点区的上游和下游均含有启动子TATA —box、CAAT—box等特征性的保守基元，推测是一个天然的双向启动子。为了在体外验证其双向 启动子完整区域的789bp序列分别以正反两个方向克隆进pUC pp38质粒中pp38报告基因的上 (CEF)，通过间接免疫荧光试验检测pp38基因的表达以验证该启动子的双向启动活性。实验结果 表明：马立克氏病病毒复制原点区的启动子无论以何种方向插入pUC—pp38质粒中，在转染转染 细胞24小时内能检测到pp38基因的表达，48小时后能获得高效和持续的表达。同时，我们通过 PCR技术，逐渐缩小该启动子的范围，最终在320bp时，仍能检测到两个方向的启动活性。 [关键词]马立克氏病病毒；pp38基因；双向启动子；报告基因 马立克氏病病毒(MDV)是一种细胞结合型疱疹病毒，对养禽业造成了巨大的损失o“]。随着对MDV基 子和增强子特有的保守序列。其上游和下游分别是与MDV致肿瘤相关的1．8kb转录子和pp38基因”’“”]。 因而，这段序列同时调控着1．8kb的转录子和pp38基因的转录”]。 研究蛋白质功能的时候，需要考虑蛋白质之间的相互作用。特别是对二聚体的研究，我们往往需要在同 一载体中表达两种蛋白质。现有的商品化载体(如pBud4．1等)是将两个不同的启动子插入同一个载体构建 而成。在植物上偶见双向启动子的报道口“，但对动物病毒中双向启动子的报道很少，更未见利用天然的双向 启动子构建的商品化载体。 为了进一步证实该启动子的双向启动活性，探索构建真核双向表达质粒的可能，我们将启动子以两种不 同的方向克隆进一种质粒中，并转染CEF细胞，通过检测报告基因pp38的表达，来证实该启动子的双向启 动能力。同时我们构建了一系列长短和方向不同的质粒转染CEF，通过IFA的荧光强度，确定了与该启动子 活性相关的碱基范围。 i材料与方法 1．1分子生物学试剂pUCl8，PCR BRL公司；质粒纯化试剂盒购于Qiagen公 司；FITC购于Sigma公司；脂质体(1ipofectamine)购于GiBco 司。 持四天以上，到出现大量细胞空斑时收获。将收集的细胞消化，抽提，最后用乙醇沉淀DNA。 1．3 重组质粒的构建参照Cui等发表的pp38基因序列03，自行合成三对引物，用于构建包括整个启动子 +项目基金；国家自然科学基金资助项目(No 作者简介：丁家波(1975～)，男，江苏泰州人。博士研究生．主要从事动物分子病毒学研究 **通讯作者 史国丝生塑堂盒璺匡堂生物专业委员会2003年学术年会 ·143· 序列在内的不同方向的表达质粒。不同引物的上下游分别引入_『各自的酶切位点．各引物序列及其相对于 pp38的位置见表1。(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。 表1用于构建不同重组质粒的PCR引物序列 Table1 Primersusedto aserialof to generate validatethe ofthe