L丝氨酸产生菌的选育及发酵条件的初步研讨.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次奎国发酵工翟学术讨论套论文集 L一丝氨酸产生菌的选育及发酵条件的初步研究 高伟，张伟国 (扛南大学生物工程学院，无铬214036) 和硫酸二乙酵(DES)逐缎谤变处理和选育，选育出一株能够以甲醇为唯一碳掉的兼性甲基 氟醺产t为6．29／L，较出发菌株提高了67．6“。该菌具有较好的传代稳定性． 关键词：I．-丝氧破}黄假单胞属}发酵}{痔变育种 L-丝氨酸属非必需氨基酸，但其作为一种生化试剂，在食品、饲料、医药、农业以及化 妆品工业中广泛应用。L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，参与许多生物物质(如甘 氨酸、蛋氨酸、瞟呤等)的合成，代谢运转速度极快。因此，与其它类氨基酸相比，L-丝氨 酸的直接发酵法生产十分困难。L-丝氨酸发酵法生产的研究报告主要集中于利用添加 前体物发酵生产L_丝氨酸，甘油酸盐(或酯)、甘油酸三甲内盐、甘氨酸被研究认为是合成 L-丝氨酸最有前景的前体物o]。 研究发现甲基营养型菌株，尤其是通过丝氨酸途径来吸收甲醇的甲基营养型菌株能 生产L-丝氨酸。一．】。在此途径中，甲醇在甲醇脱氢酶的作用下被氧化为甲醛，甲醛再同 四氢叶酸反应生成甲叉四氢叶酸，在丝氨酸羟甲基转化酶(STHM)作用下。甲叉四氢叶 酸与甘氨酸反应生产L．丝氨酸口]。 本文以实验室保藏的黄假单胞属菌A3为出发菌株。该菌不能利用甲醇，L-丝氨酸 一株带有mthR、glyR的兼性甲基营养型菌株。对该菌的发酵条件进行初步的优化，L_丝 氨酸的产量为6，29／L，比出发菌提高了67．6％。 1材料与方法 1．1菌株 黄假单胞属(Pseudomonasflava)菌A3，实验室筛选保藏。 1．2培养基(g／Ll 1．2．1基本培养基 (NHI)2SO,2，KH2POl2，K2HPO‘·3H20 0．6，MnSOl·H20 8，MgSO,·7H20 0．002，FeSq·7H20 100／19／L，制霉菌素0． 0．002，生物素50pg／L，硫胺素·HCI 05ug／L，琼脂条20。 1．2．2完全培养基 第四次垒国发酵工程学术讨论会 蛋白胨10，NaCl5，甘氨酸3，酵母膏5，琼脂条20。 1．2．3种子培养基 甘氨酸10，(NHt)=SO,15，KH：Po‘0．5，MgSOt·7HjO0．39，玉米浆15。 1．2．4发酵培养基 15，KH2P04 0．4，玉 甘氨酸0～30，甲醇0～0．6mL，(NH‘)2SOl2，Mg$Ol·7H20 20。 米浆15，CaC03 基本培养基、完全培养基和种子培养基均以20％NaOH调pH7．O～7．2，0．1Mpa 1．3培养方法 1．3．1斜面、平板培养方法 恒温箱温度31士1℃，培养24h。 1．3．2摇瓶培养方法 1．4诱变方法． 1．4．1UV、DES诱变[53 1．4．2ruth2、gly8菌株的筛选 配制基本培养基，灭菌后加入适量的药物(mth，gly)，制成不同浓度梯度的筛选乎 板。涂布上述经诱变处理过的菌液，置30C恒温箱中培养3～7d，挑取长出的菌落，即为 mthR、gly8突变株。 1．s分析方法 1．S．1pH 用精密pH试纸和酸度计测定。 1．5．2菌浓测定 吸取0．2mL样品菌液到5mL0．25mol／LHCl溶液中，摇匀，采用721分光光度计， lcm光程562nm下测定OD值。 1．5．3L-丝氨酸定性、定量分析 t 5(体积 采用纸层析方法瑚，层析溶剂为正丁醇t酮-二乙胺t水；10：lo一2 比)。定量测定利用比色定量法伽及氨基酸自动分