胺基酸、胜肽與多胜肽 Amino acid, peptide and polypeptide.pptVIP

蛋白質研究技術 研究蛋白質通常要先純化得均質蛋白質，然後檢定其分子量、次體組成及等電點等性質，最終則要定出蛋白質之胺基酸序列，或其立體三次元分子構造。 蛋白質研究技術 蛋白質純化技術 利用蛋白質分子量不同、表面帶電性或極性區域大小等性質差異，可分離純化之，包括： 硫酸銨分劃法 在蛋白質水溶液中加入硫酸銨等鹽類，會導致蛋白質因疏水性區域相吸引而聚集沉澱出來，稱為鹽析 (salting out)；鹽析可大略地純化出蛋白質，並可以除去核酸、醣類或脂質等物質。 蛋白質研究技術 蛋白質純化技術 膠體過濾法 (gel filtration) 依蛋白質分子量的大小不同，先後分離出來。 離子交換法 (ion exchange) 各種蛋白質的帶電性強弱不同，與離子交換介質間吸引力的大小會有差異，可以此進行分離 。 親和層析法 (affinity chromatography) 利用分子間專一的親和性，來吸引純化某蛋白質，最為直接；但並非所有蛋白質都能夠找到專一性的吸著劑。 蛋白質研究技術 蛋白質性質與構造檢定 蛋白質定量法 染料 Coomassie Blue 與蛋白質結合後，會由褐色變為藍色；由反應前後藍色吸光度的改變，與已知蛋白質的標準曲線比較，即可推知樣本中蛋白質的濃度，顏色越呈現藍色，表示蛋白質含量越高。一般稱之為 Bradford method。 分子量測定法 可利用膠體過濾法、超高速離心法 (ultracentrifugation) 或膠體電泳法 (gel electrophoresis) 來測定蛋白質的原態分子量。 SDS 膠體電泳則可測定次體分子量。電泳同時可以檢定蛋白質的純度如何，是解析力極佳的分析工具。 蛋白質研究技術 蛋白質性質與構造檢定 等電點 (pI) 等電焦集法 (isoelectric focusing) 類似膠體電泳，但可測得蛋白質的等電點。等電點是蛋白質帶電性質的重要指標，當環境的 pH 等於其等電點時，此蛋白質的淨電荷為零；大於其等電點時，淨電荷為負，反之則帶正電荷。 胺基酸組成 蛋白質以鹽酸水解成游離胺基酸後，再以離子交換法 (HPLC) 分析各種胺基酸之含量，即可得知各種胺基酸的含量百分比。 蛋白質研究技術 蛋白質性質與構造檢定 蛋白質立體構造 以 X 光繞射法分析蛋白質結晶，可計算出分子的細微立體構造。 核磁共振法 (nmr) 測定水溶液中蛋白質的立體構造。 質譜分析 目前的質譜儀分析(Mass)技術，已能輕易處理分子量較大的蛋白質，定出蛋白質的精確分子量；也可以分析蛋白質所列解的片段，並推出其胺基酸序列。 蛋白質研究技術 蛋白質性質與構造檢定 蛋白質研究技術 胺基酸序列決定法 傳統胺基酸定序法 傳統的胺基酸定序方法，是直接檢定胜肽鏈上的胺基酸種類 許多化學反應 (如 Edman degradation) 可由蛋白質的 N-端開始，依序一輪切下一個胺基酸，再檢定每輪切下的胺基酸為何，即可推得此蛋白質的胺基酸次序。 蛋白質研究技術 胺基酸序列決定法 傳統胺基酸定序法 若蛋白質太長，則無法有效定序後面的胺基酸序列；要先用 蛋白質水解脢 把目標蛋白質切成小段，各小段分別定序，然後再組合成長鏈。 為了排列上述各小段胜肽的先後次序，要使用兩種不同的蛋白質水解脢，得到兩套不同長短的胜肽，分別定序後，比較各片段的重疊部分，即可判斷先後。 蛋白質研究技術 胺基酸序列決定法 cDNA定序法 以基因操作方法，選殖出目標酵素的 cDNA，並將其核酸序列定出，則可推出所對應的胺基酸序列。目前大都採用此種方法，比較方便。 蛋白質研究技術 胺基酸序列決定法 質譜儀定序法 質譜儀是利用分子的質量大小來檢定樣本，因此可以精確測出分子的質量。若把蛋白質在質譜儀中撞擊，產生一群具有各種不同長短的片段，每一片段都剛好少一個胺基酸，然後用質譜儀一一測出這些片段的分子量，由所得各種片段分子量的差別，就可推出相差胺基酸的種類，乃至整段胺基酸的序列。 參考資料 Principle of Biochemistry Juang Web (.tw/) Wiki 蛋白質研究技術? 元培科技大學 生物技術系 方逸萍 助理教授 Office: 光寰大樓 H505 E-mail: ypfang@.tw X 光繞射法分析蛋白質結晶 NMR推測蛋白質骨架