SBR脱氮活性污泥总DNA提取研讨.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 SBR脱氮活性污泥总DNA提取研究 廖永红， 牟文亨， 曲艳玲，祖丹丹 (北京工商大学化学与环境工程学院．北京100037) 摘要：本文就提取SBR脱氮反应器中活性污泥总DNA的预处理、细胞破壁、去酴蛋白质 等方法进行了比较研究．将不同方法提取得到的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，紫外吸光 度和ERIC-PCR检测．结果表明，采取TENP、PBs溶液和玻璃珠震荡对活性污泥进行预处 理，SDS和物理冻融结合破碎细胞，一次酚／氯仿和饱和NaCl溶液离心去除蛋白质的DNA 提取操作，可以得到腐殖酸、蛋白质合量较少的活性污泥DNA样品。本研究发现：从活性污 泥提取的DNA样品中舍有对PCR反应体系有明显抑制作用的杂质．通过稀释，控制DNA 增。ERIC-PCR得到的DNA产物凝胶电泳结果：条带清晰稳定有特异性。为进一步应用分 子生态学方法研究活性污泥的性质莫定了基础。 关键词：活性污泥；脱氮；DNA提取’PCR扩增 随着分子生物学技术的广泛使用、微生物基因组序列测定工作大规模开展、功能基 因组学和生物信息学的迅速发展，使人们可以通过绕开微生物菌种分离培养这一步骤， 直接在基因水平上研究和开发未培养微生物资源cl’2]，实现对复杂和不可培养微生物菌 群的了解。 在活性污泥对废水进行脱氮的过程中，随着污泥膨胀、脱磷脱氮效率降低等问题的 不断出现，促使人们对该体系中微生物的复杂群体结构与系统运转工艺之间的关系进行 研究。目前，通过提取活性污泥总DNA而进行的有关污水处理系统中微生物群体的多 样性、系统发育地位、种群结构以及与功能的相关性的研究已成为研究热点[3]。在基因 水平上研究未培养和不可培养微生物技术的关键之一是从各种环境样品中高效地获得 可进行分子操作的混合基因组DNA。活性污泥理化性质复杂且环境影响多样，使分离 和提取DNA困难，因此，建立进行分子生态和功能多样性研究的特异性DNA的有效提 取和高效纯化方法具有重要意义[1]。本文就提取活性污泥总DNA的样品预处理、细胞 破壁、去除蛋白质等方法进行了比较研究。建立了对本实验室高效脱氮活性污泥总 性。 1 材料与方法 1．1实验材料 研究所用活性污泥取自北京工商大学化工楼307实验室的SBR反应器。 1．2实验方法 ． 530 第四次全国发酵工程学术讨论会 1．2．1取样 将混合均匀的活性污泥样品在常温下静置30min，倒掉上清液，保存于4C冰箱48 小时内实验使用。 1．2．2样品的预处理 溶液。300r／min震荡2min。80009／4℃／5min离心，弃上清液。 B方法；A方法中去掉玻璃珠震荡步骤。 C方法：活性污泥直接离心得到浓度较高的样品，作为对比组。 1．2．3细胞破碎 Eppendorf管。500r／rain漩涡震荡5min。 A．超声波破碎：100％功率对Eppendorf管样品进行10rain的超声波处理。 B．高温破碎：样品Eppendorf管，垂直放置于70℃水浴30min。 C．冻融破碎：根据不同温度变化跨度和快慢设计出四种方法： ②将样品放在一20℃冰箱15min，50℃水浴2rain。重复3次。 ③将样品用液氮浸泡30秒，50℃水浴2min。重复3次。 ④将样品放置在·20℃冰箱15min，90℃水浴2min。重复3次。 E．液氮研磨破碎：将样品涂布于研钵底部，均匀撤上等体积石英砂。添加液氮至样 品冻成固体，研磨。直至样品变成灰白色的粉末。用试剂勺柄装入Eppendorf管，加入 600,ul提取缓冲液。500r／min漩涡震荡5rain使样品和缓冲液混匀。 1．2．4蛋白质的去除 A方法：酚／氯仿、氯仿去除；B方法：饱和NaCl溶液、酚／氯仿去除；C方法：酚／氯 仿、饱和NaCl溶液去除；D方法：饱和NaCI溶液去除。 1．2．sDNA的分离提取 异丙醇、70％酒精提取，TE缓冲液一20℃冰箱内保存。 1．2．6