细胞工程7胚胎干细胞培养.pptVIP

细胞工程 第一章 　绪论 4个学时第二章 　实验室配置及基本技术 2个学时第三章 植物细胞工程的理论基础 4个学时　第四章 　植物组织器官培养技术 6个学时第五章 　植物细胞培养及次生代谢产物生产 3个学时第六章 　原生质体培养和体细胞杂交 3个学时第七章 　人工种子及植物种质资源保存 2个学时 第八章　　胚胎干细胞培养 2个学时 第九章　　动物细胞培养　　　　　 4个学时第十章　　动物细胞融合与单克隆抗体 4个学时　　　第十一章　动物组织与胚胎工程 1个学时　　　　　　第十二章　试管动物与克隆动物 1个学时 第七章 胚胎干细胞培养 胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。 --来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES） --来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG） --来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonal carcinoma cells, EC） 成体干细胞（adult stem cells, AS），也叫作组织干细胞（tissue stem cells） 是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。 --造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。 --骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。 ES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件选择等手段，是一条可能的探索ES细胞定向诱导分化的途径。 哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能； ES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系； 许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。 2、ES细胞体外诱导分化的基本方法 单层ES细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞 ES细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较 单一,具体方法有： （1） 软琼脂培养 （2） 悬滴培养 制备ES单细胞悬浮液 培养皿盖上接种 20ul/滴，直径10cm的培养皿盖 盖上带有悬浮细胞小滴的盖子 培养皿内加PBS 培养皿边缘用膜封 置37℃，5％CO 2培养箱培养 3d后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养 然后,移放入铺有0.1%白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养 可被诱导分化为不同类型细胞 ES细胞体外悬滴培养 3、ES细胞体外诱导分化举例 造血细胞 内皮细胞与血管 神经细胞 脂肪细胞 心肌和其他肌肉细胞 软骨细胞 胰岛细胞 小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细胞： ①用胰蛋白酶消化小鼠ES细胞拟胚体成单个细胞，经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和条件培养液处理，诱导其定向分化为造血干细胞； ②用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细胞因子处理 可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。 造血细胞 内皮细胞与血管 小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，其中也有内皮细胞出现： ①利用经转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染的小鼠ES细胞在含RA培养液中经悬滴培养形成拟胚体； ②再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。 将外源重组TGF-β1添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。 心