运用BIAcore技术研究G蛋白与腺苷酸环化酶的结合反应研究.pdfVIP

面向2l世纪的植物保护发展战略 运用BIAcore技术研究G蛋白与 腺苷酸环化酶的结合反应 陈巨莲‘倪汉祥1孙京瑞1Gezhi Ravi Wen92 lyengar2 (1．中国农科院植保所北京100094；2．DepartmentofPharmacology MedicalCenterofMount York 1 Sinai，New University,NY0029) 摘要应用表面质膜共振(SPR)技术，采用传感芯片?eTA(sensoFchip．Ⅵ’A】首次证 明G蛋白D-p亚基直接作用于腺苷酸环化酶2(Ac，)的胞质尾巴c：区域，而且活性位点和结台位 点同位于该区域。研究结果为今后开展G蛋白在昆虫信号传导中的作用和小麦抗蚜分r机理奠 定r基础。 PIasmon BIAcore技术是一种队渐消失波方法为基础的表面质膜共振(Surface Resonance，SPR)技术，其优点队测定折射指数这一物理量的变化监测细胞内或离体的蛋白 与蛋白互作的即时反应，不需要对所研究蛋白质进行任何修饰，而且适用大分子之间互作的亲 和力范围很广， 因而被普遍用于生物大分子互作关系定量研究{Schuck，1997)， 关键词表面质膜共振(SPR)技术BIAcore技术G蛋白腺苷酸环化酶(AC) BIAcore技术利用在金属／液体界面发射一个表面质膜波研究分子之间的结台。一个 相互作用的组分固化在装备好的传感芯片(sensor chip)上，另一个组分从缓冲液中流过， 分子之间结合反应引起芯片上折射指数的改变，即为监测的SPR信号的改变，用分子动力 学方程及有关参数来确定其结合情况。 腺苷酸环化酶(AC)是研究G蛋白效应物的最早例子。它是质膜上一种酶，受G蛋白直 接凋控，能催化腺苷三磷酸(ATP)产生环腺苷酸cAMP。目前，哺乳动物的AC的9个同 工酶(isoform)都被克隆，据推断这些AC具有相似的二级结构：一个短的氨基末端，6 et 个跨膜螺旋和一个C一末端胞质尾巴(Wenga1．，1998)。许多生化和分子生物学研究 表明，不同AC同工酶受调控方式不同：所有同工酶都能被G蛋白d亚基一个亚型Gas所激 活，GD7对AC的各种同工酶的调控存在差异，只有部分AC能被G阶亚基所激活。腺苷酸 环化酶2(AC2)与∞和GBT亚基互作的区域为AC2的C一末端尾巴区域C2(C2domain)， 该【蔓域与G137相互作用有关。同工酶AC,和AC·与AC2结构很相似，也受GD7激活；而其他 eta1．1998)， 同工酶，如：AC,、Ac6、AQ不受Gp7亚基的的调控(Weng推断G断对不 同的AC同工酶作用不同可能与G[37结台力不同有关。 et 另据研究(Weng 能抑制G断对AC2刺激活性，它能与G叶的6亚基共价结合。为了进一步从亲和力角度比较 G所与AC不同亚型的结台能力，以及QEHA肤段对G口7与AC互作的影响，开展了本项研 究，旨在建立用SPR技术直接监测蛋白质之间互作关系研究方法，更好地利用该技术，揭 示G蛋自信号组分与未知蛋白之间互作关系提供理论依据。 陈巨莲等：运用BIAcore技术研究G蛋白与腺苷酸环化酶的结合反应 787 I材料与方祛 1．1蛋白质纯化 Wei～Jen博士试验室惠赠， G1j,72蛋白纯化(另文发表)。AC由Chicago大学Tang 在C一末端尾巴上带6个组氨酸标记的AC2用E．coliBL21(DE，)表达，通过Ni—Nr