肝素酶及肝素寡糖研讨.pdfVIP

摘 要 细菌肝素酶是一类能够以裂解方式降解肝素和/或硫酸乙酞肝素的酶类。本 文首先从一个鞘氨醇杆菌新种发酵培养的菌体中用三步渗透压法得到肝素酶粗 酶液。进 一步经过阳离子柱层析SP-Sepharose和 Source-30S后，得到在 SDS上表观电泳纯的肝素酶。纯化后酶蛋白的比活力为 17.61U/mg蛋白， 纯化倍数为 13倍。基质辅助时间飞行质谱法测定的活性酶分子量为75KDa，和 SDS推测的变性酶分子量一致，说明肝素酶为单体酶。N一端测序结果表明 其序列为N-GKSSISGEDF.酶蛋白经胰蛋白酶水解后的肤谱分析表明，该酶和肤 库中的蛋白同源性极差。酶的化学修饰剂处理显示酪氨酸可能是肝素酶的必需氨 基酸。以脱一。一硫酸-N一乙酞肝素作为底物，测得该酶的/Cm值和 Gfiax分别为42刚 和 166jiM/min/mg蛋白。用肝素类似物和肝素衍生物作底物分析肝素酶的催化专 一性，发现N一位点的去修饰化导致酶活的极大损失，而0-位点的去硫酸化则对 酶活力有正效应，说明其主要以内切方式裂解肝素链中的低硫酸化区域。鞘氨醇 杆菌肝素酶以上的酶学性质和底物专一性在诸多方面不同于肝素黄杆菌及其它 已报道菌株所产生的肝素酶，是一个新的内切型肝素裂解酶。 将纯化后的内切型肝素酶固定于聚酷载体上，固定化效率达78.8%。固定化 酶最适pH为7.5，在pH7.0左右有较好的稳定性。最适反应温度为400C，热稳 定性较差。催化肝素底物反应的Km值约为95.OM。固定化酶可以同时作用于肝 素和硫酸乙酞肝素，对硫酸软骨素没有催化能力。高效液相色谱分析固定化酶降 解肝索的产物时一，发现产物中含有一定量的非硫酸化或低可流酸化的二糖和不同聚 合度的寡糖混合物，而没有大量三硫酸化二糖的特征峰，体现了和游离肝素酶- 致的性质。这将为肝素酶在肝素寡糖药物的研制和寡糖库的构建中的应用起到积 极的推动作用。 本文还采用不同方法对肝素酶降解肝素产生的肝素寡糖混合物进行分离和 纯化。首先用8000Da,5000Da,1000Da的超滤膜依次截留寡糖棍合物获得小同片 段范围的混合物。从小于l000Da的截留组分中用半制备型高效液相色谱纯化得 到5个主要的二糖组分。正相毛细管电泳技术可以部分分离二糖混合物。将高效 液相色谱和凝胶电泳技术相结合，初步对1000Da-5000Da的片段进行纯化，发 现该方法可以较为有效地分离大片段肝素寡糖分子。此外，木文还用计算机软件 s丫BYI」模拟了肝素结构中双硫酸化硫酸二糖的构象及带电特征，分析表明不同位 点的硫酸化nJ一能影响分子整体带电特征，这既解释了双硫酸化硫酸二糖在高效液 相色i中发生峰型漂移的现象，也为肝素结构和功能分析提供一定的理论依据。 用电喷离子化质谱和毛细管电泳技术鉴别了上述分离到的五种肝素二糖结 构。对应于液相色谱中五个主要色谱峰的保留时间，五种二糖分为三类，第一类 (液相峰 I)质谱特征峰为378.3，分子量 379.3，代表未硫酸化的乙酞化肝素 二糖;液相峰II和工II在质谱中得到分子量为417和459的化合物，前者为未 乙酞化的单硫酸化二糖，后者为乙酞化单硫酸二糖;液相峰IV和V的质谱峰特 征 一致，是双硫酸化的 (但未乙酞化)肝素二糖。将上述样品进行毛细管电泳鉴 别，保留时间依次约为2.88,4.05,4.25,7.32和 7.65min。未硫酸化的标准 样品的保留时间2.84min。三硫酸化标准二糖则出现拖尾现象。五个二糖样品都 落在了标准品的保留时间之间，进一步证实从质谱中得出的二搪结构。在肝素二 糖的分离和鉴别过程中，没有发现肝素结构中较为普遍存在的三硫酸肝素二糖结 构，这是完全不同于已经报道的肝素酶作用底物的特性，为寻找功能肝素寡糖片 段以及肝素寡糖的结构与功能研究奠定很好的基础。 关键词:鞘氨醇杆菌，肝素酶，快速纯化，底物专一性，固定化肝素酶，肝素二 糖，结构 Studiesonheparinaseandheparinoligosaccharides ChaoYapeng(BiochemistryandMolecularBiology) DirectedbyProf.QianShijun Abstract Heparinasewasproducedbyanovelspeciesof助hingobacterium.