3 细胞培养的基本原理与技术.ppt

细胞培养基的基本知识 三、无血清培养基 1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。 其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的组合成适合大多数细胞培养的试剂配方。 细胞培养的基本原理与技术 广州中医药大学第一附属医院实验中心 梁 毅 2011-10-10 体外培养 体外培养（in?vitro?culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 细胞培养分为原代培养和传代培养。 体外培养的种类 ●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 ●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 细胞培养的特点 简化了环境因素、排除了体内实验时一些复杂的因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和提示细胞生命活动的规律； 便于应用各种不同的技术和方法观察和研究细胞结构和功能的变化； 可以长期观察和研究细胞遗传行为的改变； 提供了大量生物性状相同的细胞，特别是人的活细胞材料作为研究对象； 经济、便利，解决了不能用人做实验的问题。 细胞培养的无菌环境 无菌室? 一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 细胞培养的无菌环境 超净工作台 细胞培养的设备器材 一、大型设备工具类 无菌室、超净工作台； 二氧化碳培养箱、水浴箱、试管架； 倒置显微镜、普通显微镜、照相系统； 低速离心机（水平式500-4000r/min）及低温高速离心机； 普通冰箱、低温冷藏箱（－80-－30℃）及液氮罐。 细胞培养的设备器材 二、消毒灭菌设备 高压蒸汽灭菌器； 干热灭菌器； 滤过器、滤过瓶、抽滤泵、微量超滤膜滤器等； 紫外灯、离子发生器； 耐酸耐高温容器、吸管自动冲洗器、玻璃器皿清洗箱。 二、消毒灭菌设备 二、消毒灭菌设备 细胞培养的设备器材 三、配液用具 蒸馏水制作系统、超纯水制作系统； 电子天平； pH仪或试纸（精密）； 量筒、漏斗、容量瓶、磁力搅拌器。 细胞培养的设备器材 四、制备、培养、保存细胞用品 刀、剪、镊等解剖用具，80-200目尼龙网或不锈钢网，血细胞计数器； 培养瓶、培养管、离心管、细胞培养板（4孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔）； 吸管、滴管、试管； 涡流混悬器、恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器； 细胞冻存管、玻璃安培、真空低温干燥器。 常用培养器皿的清洗消毒 三个步骤：清洗、包装、灭菌； 区分不同材质培养器皿：玻璃、橡胶、塑料、金属等。 常用培养器皿的清洗消毒 清洗、包装 玻璃器皿的清洗?一般经过浸泡、刷洗、浸酸、清洗四个步骤。 橡胶制品清洗 塑料制品的清洗? 包装 常用培养器皿的清洗消毒 消毒和灭菌：微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因? 物理消毒法： 紫外线消毒：通过直接破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，和间接产生臭氧杀死微生物。可杀死多种微生物，革兰氏阴性菌最敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢。直接照射房间和工作台面。 常用培养器皿的清洗消毒 物理消毒法： 高温湿热灭菌：压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。 不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。 煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。 常用培养器皿的清洗消毒 物理消毒法： 高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。? 干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。 烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。 常用培养器皿的清洗消毒 物理消毒法： 过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。 常用培养器皿的清洗消毒 化学消毒： 0