环介导恒温扩增技术用于呼吸道合胞病毒的检测.docVIP

精品论文 参考文献 环介导恒温扩增技术用于呼吸道合胞病毒的检测 王滔 林瑜 陈俊扬 叶礼鸣 蒋云林 (福建省立医院福建省儿科研究室 350001) 【摘要】目的 采用环介导恒温扩增技术建立快速检测儿童呼吸道合胞病毒的方法。方法 收集福建省立医院2011—2012年儿科疑似急性呼吸道感染患儿的呼吸道分泌物标本137份，同时采用环介导恒温扩增技术(LAMP)和荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒特异性RNA，分析两者的灵敏性和特异性。结果 LAMP法在恒温条件下进行，特异性好，其灵敏度和可靠性与荧光定量PCR方法相当。结论 LAMP方法具有灵敏度高、特异性强等优点，仅需简易设备就能快速、高效、简便地对病原微生物进行鉴定，是一种快速检测呼吸道合胞病毒的新方法。 【关键词】 呼吸道合胞病毒 环介导恒温扩增技术(LAMP) 基因检测 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）18-0233-02 人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，hRSV)是引起婴幼儿冬春季下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一[1]。环介导恒温扩增[2](LAMP)技术具有高效、简便等特点。为此本文采用LAMP技术对疑似呼吸道感染的患儿鼻咽分泌物中的呼吸道合胞病毒进行检测，并与荧光定量PCR技术检测结果比较，探讨其临床应用价值。 1 材料和方法 1.1 材料：(1)生物试剂：Bst DNA聚合酶为新英格兰biolabs公司产品，pMD19-T载体和MiniBEST Viral RNA提取试剂盒购自宝生物公司。ScriptMAX TM Thermo T7试剂盒由上海硕盟生物科技有限公司提供。LAMP引物由宝生物公司合成。RSV荧光定量PCR试剂盒由达安基因股份有限公司出品。(2)鼻咽分泌物样本：收集2011—2012年福建省立医院儿科(住院及门诊)疑似急性呼吸道感染患儿的呼吸道分泌物标本137份，患儿(年龄30d-14周岁)。鼻咽分泌物标本采集按[3]方法取得。 1.2 方法 1.2.1 实时荧光PCR方法检测呼吸道合胞病毒：按照说明书方法进行。 1.2.2 LAMP检测呼吸道合胞病毒： 1.2.2.1 引物设计：LAMP引物设计采用Loopamp公司的LAMP Primer Explorer软件，参照文献[4]根据呼吸道合胞病毒2个亚型(A型、B型)基因的6个区域设计4条特异引物，包括2条外引物F3、B3，2条内引物FIP、BIP和2条环引物LF、LB。引物序列见表1、2。 表1 LAMP检测呼吸道合胞病毒A亚型的引物序列 1.2.2.2 病毒RNA抽提：按照[3]处理鼻咽分泌物样，采用Mini BEST Viral RNA提取试剂盒说明书方法制备RNA，-8O℃保存(含RNA酶抑制剂)。 1.2.2.3 反转录反应：20ul反应混合物：4u1 MgC12，0.5ul RNase抑制物，4ul 5times;反应缓冲液，2u1 dNTPs，5.5ul RNase Free dH2O，1ul AMVase，1ul随机引物和2ulRNA样品。反应混合物于30℃温育10min，置42℃45min，然后99℃沸水浴5min以终止反应。 1.2.2.4 环介导的反转录恒温扩增反应：反应扩增体系含：1.0ul 10mM dNTPs，2.5ul 10times;反应缓冲液，简并引物(F和B引物各5 pmol，FIP和BIP引物各25pmol) ，补双蒸水至23ul。加1ul模板DNA后，95℃5min，置冰浴3min，加入1ul Bst DNA 聚合酶。然后，62℃温育45min，80℃5min以终止反应。反应结束后取2ul反应产物，3%琼脂糖作常规EB染色电泳，观察结果。标准阳性样品RT-LAMP扩增产物作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。 1.2.2.5 标准阳性样品的制备及反应：分段合成引物F3和B3所覆盖的呼吸道合胞病毒代表株克隆至pMD19-T载体，并亚克隆到PET- 28a(+)载体，用ScriptMAXTM Thermo T7 Transcription Kit从载体上转录RNA，同上述方法进行LAMP。 2 结果 2.1 LAMP检测