大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达研究.pdf

研究论文与综述 全国第六届工业生化学术会议 (1999,福建)论文集 仲 _ 一 一 一 一 ~~- 一 一 - 一 大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达 韦平和 吴梧ip1张玉彬 (d国药科大学生化教研室、南京2(00091 套 摘要:，、用PCIM术从E.cotiJM105中扩增忠长约I.4kb的色氨酸酶基因，将其 插入高表达我体pET3a的NdulB,amHltiA.中，转化宿王菌E,coliBL21(IM )， 构建高产色 酸酶基因工程菌 SDS电泳和薄层扫描表明 二程菌色氛酸嗬 的表达量占红胞总可溶性蛋白的69.8%.酶活测定结果表明，7株工程菌色氮酸酶的 活力比宿主菌均有不间程度的提高，一终中WW一11号比宿主菌高164ht, 关键词:L 色氛酸，色氮酸酶、PCR,3t隆、表达，基因工程菌 L.一色氨敌是 、体和动物体内的RII要氨基酸，在xI药、食品和饲料添加刊等方01?有广泛的 用途 L一色氨M的生产方法有四种即蛋日水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化 法，其中酶促转化2r..月前廉价生jL一色I酸较为有效的工业化方法Lti J」 色氨酸的酶促转 化途径主要涉及两和酶 一是色氨酸加戊酶(EC42.1.20)，另一是色氨酸酶(EC4.1.99A)， 这两种酶均可催化L 丝酸和Ails台X111.一色氨酸is飞 尽:6色A,酸合成所i}]动力学特征明显优于 勿 色氨酸I 们ulIN;,其强烈抑制，肉色RA酶对51A则具有良好的稳定性，所以近年来人们普遍 将往意力集中子色-4i酸酶,井用米催七L一色氨酸的生物合成4」 Deeley等 (1981)’#0道fE.coliK一12的色x,01酶推因序h)1,Shibatani等 11989)”‘’ 克隆了Alcaligeaes加.Ili$的色氨酸酶Vi51,-C程菌色氨酸酶产4比野生菌高4倍 ‘Tam等11990 )，〔’构建一J含色氮酮酶基因的重组质粒pMD6B,转化宿T菌E.COIiK一L2MD55.C程菌色氨 酸酶表达量占整个可爪性蛋白的30% 张l彬等(199611构建重组质tZpTase9,转化宿主菌 E.cohJM105,其色试酸酶表达量占Ai4}总蛋自的301,似酶活I:IR供体菌的2倍 鉴于L一色 氨酸在医药1_的重fl,}以及用J一生产J 色氨酸的基因工程菌研究现状，我们设计一r 、对引物， 利用PCR.技术从Exni,JM10514}i}.R`:r色氨酸酌基因 井将itM人带有强T;N动子的高表达载 体pET3a中，转化宿jAE.cohBL211DE31,以构建和筛选高产L一色氮酸酶基因1_程菌，为 今后进 一步运用酶 1A技术工业化生产L 色氨酸奠定基础 1 材料与方法 每 (略) ‘ 2 结果 2.1色氮酸故基因的PCB扩增 将PCR扩增产物在 %琼脂糖凝胶_t电沐，可得到一条长度约1.4k6的DNA片段，盼片段与 Deeley等(1981)报道的的色氨酸酶基C* T〔naA)大小一致 E.Cali色氨酸酶基因t存在单- 130 研究论文与综述 全国第六届工业生化学术会议 (1999,福建)论文集 Pstl酶切位点(51用该限制性内切酶消化PCR扩增产物，又可得到O.Skb和0.6kb的两个片段 (见图1)_ ， 图1 PCRP物的琼脂凝胶电泳 . 2.2色氮酸酶表达质粒的构建及鉴定 I#IBamHl,Ndel消化经纯化的pET3a和PCR扩增产物，16(连IC1夜