基因工程5-PCR.ppt

反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用Taq DNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可达4×106。 出现平台期的原因可能有： ①后期循环酶浓度或聚合时间不足； ②引物耗尽； ③dNTP耗尽； ④产物浓度过高，以致dsDNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。 第二节 PCR产物的克隆 一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 为了使 PCR 产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点。在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，在引物的 5 末端添加酶切位点的序列以及保护序列。在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的 DNA 片段内部不存在。如果对扩增的 DNA 片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为 8 个碱基序列的酶切位点。 二、A/T克隆法 Taq DNA 聚合酶具有末端转移酶的活性，可在 DNA 片段的 3‘ 末端添加一个核苷酸，通常为 A 。因此，Taq DNA 聚合酶扩增的产物可与 T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。T-载体最初由 Promega 公司开发出商品，并一直沿用到现在。这些载体特点是，将普通的克隆载体切成线状，并使之在 3 末端含有一个凸出碱基 T 。 在 DNA 的 3 末端添加一个 T 碱基的方法有很多，如用末端转移酶和底物 ddTMP 可以产生单个 T 的突出末端；有些识别不对称序列的限制性内切酶，如 Mbo Ⅱ 、XcmⅠ 和 HphⅠ，在切割 DNA 后可直接产生一个 3 突出的 T ；用 Taq DNA 聚合酶和高浓度的 dTTP 也可产生 3 突出的 T 。 ? A/T 克隆法现在也有了新的发展， Invitrogene 公司开发了一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。从 Vaccinia 病毒来的拓扑异构酶Ⅰ可以结合在双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键，释放出的能量可催化 DNA 切口处的 3 磷酸基团与拓扑异构酶 的第 274 位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处 5 羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键，重新将 DNA 连接起来。 pCR-TOPO 载体就是根据拓扑异构酶 Ⅰ 的这一性质来开发的， pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。 pCR-TOPO 载体的工作模式图 pPCR-Script Amp SK（+）克隆载体 ? 该载体从 pBluescript Ⅱ SK（+）噬菌粒改造而来，只是将多克隆位点中的 XbaⅠ和 SpeⅠ 位点改成 SrfⅠ 位点（GCCC / GGGC）。克隆 DNA 片段时，先将载体用 SrfⅠ切成线状，再与目标 DNA 片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加 T4 DNA 连接酶外，还加入 SrfⅠ 酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后， SrfⅠ 酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。只有当载体与目标 DNA 片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目标 DNA 片段连接这个方向倾斜。 用于克隆具3’-5’外切活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物. 三、平末端DNA片段的克隆 pPCR-Script Amp SK（+）酶切与连接动态平衡示意图 pCR-Blunt 克隆载体??? pCR-Blunt 是另一种用于提高克隆平末端片段效率的载体，该载体最大特点是在 lacZ‘ 基因的下游融合了一个 ccdB 基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为 3.5kb ，含卡那霉素抗性基因和 Zerocin 抗性基因。在克隆外源平末端 DNA 片段时，先将该载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源 DNA 片段与载体连接后， ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。 ccd : control of cell division，抑制细胞分裂系统。 ccdB蛋白：细胞毒性蛋白，干扰DNA旋促酶的活性。 ccdA蛋白：ccdB蛋白的抑制蛋白。 第三节 PCR扩增未