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第4章 人工染色体载体 黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体 表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性 载体 容量（kb） 复制子 宿主 拷贝数 重组DNA导入宿主的方式 筛选标记 克隆DNA获取方法 黏粒 30-45 ColE1 大肠杆菌 高 转导 — 碱抽提 P1 70-100 P1 大肠杆菌 1 转导 sacB PAC 130-150 P1 大肠杆菌 1 电转化 sacB BAC 120-300 F 大肠杆菌 1 电转化 α-互补 YAC 250-400 ARS 酵母菌 1 转化 ade2 脉冲场电泳 4.1 黏粒载体 4.1.1 黏粒的结构特征和用途 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒。cos序列是?噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性标记（ampr）、cos位点，能像质粒一样转化和增殖。 它的大小:5-7kb，用来克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。 4.1.2 黏粒载体的工作原理 图4-1 黏粒载体克隆DNA的一般原理和步骤 4.1.3 黏粒克隆载体 1．黏粒pJB8 大小为5.4kb，由ampr，ColE1复制起点（ori），cos位点，多克隆位点组成，可容纳33-46.5kb外源DNA片段（图4-2），主要用来在细菌中克隆真核DNA。 图4-2 pJB8图谱 2．含双cos位点的黏粒载体 c2RB和Supercos-1是含双cos位点的黏粒载体，c2RB大小为6.8kb，含两个cos位点，在cos位点之间有Kanr（图4-3）。 装载容量33-46.5kb 图4-3 黏粒载体c2RB图谱 4.2.1 YAC载体的复制元件和标记基因 最常用的是pYAC4。 工作状态:线状的。 为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。 YAC载体必须含有元件 YAC载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件： ①端粒重复序列（telomeric repeat， TEL），定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 ②着丝粒（centromere， CEN），有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 ③自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。 YAC载体的选择标记 采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变抑制基因sup4。 与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。 利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。 宿主菌：赭石突变:突变为 UAA，红色菌落 载体上：赭石突变抑制基因sup4 4.2.2 YAC载体的工作原理 YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库。 图4-5 酵母人工染色体载体 图4-6 pYAC4载体工作原理图 外源DNA片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，使重组菌形成红色菌落； 载体自身连接转入到酵母细胞后形成白色菌落。 4.3 细菌人工染色体载体 细菌人工染色体是基于大肠杆菌的F质粒构建的高通量低拷贝的质粒载体。 F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质。 虽然F质粒通常以双链闭环DNA（1-2拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合。 携带F质粒的细胞（以游离状态或以整合状态）可表达发样状的性菌毛，通过性菌毛F质粒可以转移给受体细胞。 4.3.1 BAC载体及其结构组成 约7.5kb，其本质实际上是一个质粒克隆载体。 复制单元的特殊性:来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS，启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE）以及3个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA、parB和parC）。 低拷贝性可以减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 标记基因:氯霉素抗性基因 图4-7 B