生物膜与鲍曼不动杆菌耐药性的相关性研究.docVIP

精品论文 参考文献 生物膜与鲍曼不动杆菌耐药性的相关性研究 闫高波（辽宁省丹东市中心医院检验科 辽宁丹东 118002） 【中图分类号】R378.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）23-0061-02 【摘要】 目的 通过研究鲍曼不动杆菌生物膜与耐药性的关系，为防治因鲍曼不动杆菌造成的感染提供理论依据。方法 对临床导管标本分离的鲍曼不动杆菌进行鉴定，采用刚果红培养基筛选鲍曼不动杆菌生物膜的模式菌株，并观察导管材料表面形成的生物膜结构。结果 刚果红法检测能够形成生物膜的鲍曼不动杆菌的模式菌株阳性率68.0%（17/25）；扫描电镜观察到细菌聚集，由纤维素样物质交联，甚至堆积，耐药株发现温和噬菌体。结论 鲍曼不动杆菌在导管中因产生生物膜，形成屏障导致对抗生素耐药；耐药株菌体表面的温和噬菌体可在耐药性传递中发挥作用。 【关键词】 鲍曼不动杆菌 生物膜 耐药性 1 资料与方法 1.1材料 细菌来源 标本分别来自丹东市中心医院检验科的尿、痰、气管吸出物、血液、脑脊液等，共收集100例标本（见表1）。首先涂片，革兰染色，镜检，可疑菌进行分离培养。其中血液和脑脊液标本首先进行LB肉汤增菌培养，标本接种于中国蓝平板42℃培养过夜，青霉素middot;诺氟沙星平板37℃培养过夜，可疑菌落于中国蓝培养基中纯化，得到的纯化菌株经生物一梅里埃公司ATB细菌鉴定仪鉴定到种。 1.2主要试剂及仪器 1.2.1 试剂 刚果红培养基：刚果红（国产分析纯），自制牛心脑浸液干粉，琼脂粉（汕头达豫精细化学品公司），蔗糖（北京化学试剂二厂）按文献[4]配制；ID 32 GN革兰阴性杆菌鉴定试条（Ref.32 100）试剂条； 1.2.2 仪器 生物梅里埃ATB细菌鉴定仪，Innova40震荡培养箱。Nikon 80I显微镜，离心机Sigma 1-14， 1.3方法 1.3.1 菌种鉴定 1初步鉴定 直接涂片 革兰染色；氧化酶、硝酸盐还原试验、动力实验阴性 2）菌种鉴定 采用ATB生化鉴定分析仪，按ID 32 GN革兰阴性杆菌鉴定试条（Ref.32 100）说明书进行鉴定。 1.3.2 生物膜定性 1）选择已提纯的鲍曼不动杆菌菌落接种于刚果红培养基上，37℃培养一周左右，形成生物膜的菌落变为棕黑色，不形成生物膜的菌落仍为白色。 2）将经过初步确定可形成生物膜的菌株接种于LB肉汤中，调细菌终浓度为0.5麦氏单位，同时设阴性对照组为枯草杆菌（0.5麦氏单位），阳性对照组ATCC19606（0.5麦氏单位）；肉汤对照组、生理盐水对照组为空白对照组。无菌条件下将临床常用的一次性硅胶导管圆片（经过高压灭菌），直径5mm，浸入其菌液中，封口膜封口防止污染 37℃培养，Innova40 温控摇床震荡，振幅为50Hz，每隔24h取出，用盐水冲洗，除去浮游菌，换新培养液，持续7d。取出导管片用无菌生理盐水2ml反复冲洗3-5次，洗去浮游菌，置于2.5%戊二醛溶液中于4℃冰箱固定24h，以PH7.2的磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次10min，再以1%的锇酸4℃固定2h，4℃双蒸水冲洗3次，梯度乙醇脱水（以50%、70%、80%、90%、95%两次、100%三次，每次脱水时间10min），醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷金镀膜，通过KYKY-3200 SEM进行观察。 1.3.3 鲍曼不动杆菌超微结构的观察。 2 结果 2.1菌种鉴定 鲍曼不动杆菌革兰染色为阴性球杆菌，多为成对排列；无芽胞、无鞭毛，较难脱色，氧化酶、硝酸盐还原试验、动力试验阴性。 100例临床标本中分离出鲍曼不动杆菌25株，ATB生化鉴定菌株：纯度为99.9%。 表1 标本来源 2.2 25株鲍曼不动杆菌中有17例在刚果红培养基上形成黑色菌落。为生物膜的模式菌株，阳性率为68.0%。另8株菌在刚果红培养基培养，菌落始终为无色。 2.3鲍曼不动杆菌的耐药情况： 表2 鲍曼不动杆菌耐药性检测 表注： 鲍曼不动杆菌杆菌的耐药率：84.0%（21/25） 2.4.鲍曼不动杆菌形成的生物膜（图1） A 鲍曼菌培养3d B 鲍曼菌培养5d C 鲍曼菌培养7d D 枯草杆菌阴性对照 图1 扫