免疫学检测技术的基本原理免疫学教材.pptVIP

湖北理工学院精品课程;第二十二章 免疫学检测技术的基本原理;第一节 抗原或抗体的体外检测;2、抗原-抗体反应的可逆性 非共价键结合的抗原-抗体复合物不稳定，降低溶液的pH值或提高溶液的离子强度，可使抗原-抗体复合物离解（即具可逆性）。 3、抗原-抗体反应的可见性 抗原与抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于二者的比例和浓度。 4、抗原-抗体反应的阶段性 分为两个阶段，第一个是抗原-抗体特异性结合阶段，其特点是反应快，一般不能为肉眼可见；第二阶段为反应可见阶段，根据参加反应的抗原物理状态的不同，可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象，其特点是所需时间长，且受电解质、温度和酸碱度等因素的影响。;二、抗原-抗体反应的影响因素 1.电解质 抗原和抗体在中性和弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分负电荷???相互结合，出现肉眼可见的凝聚团块或沉淀物。抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。 2.温度 较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。常用37℃水浴保温。 3.酸碱度 血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。;间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)：将已知Ab 先与被检的可溶性Ag混合，隔一定的时间后再加入致敏颗粒，如果已知抗体与被测抗原结合，不再出现凝集现象者称为间接凝集抑制试验。常用与妊娠诊断，即用乳胶间接凝集抑制实验检测早期妊娠妇女尿中的绒毛膜促性腺激素。 左侧对照实验：出现均匀的凝集颗粒。妊娠诊断试验阴性：出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无HCG。妊娠诊断试验阳性：不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有HCG。 凝集（试验阴性）不凝集（试验阳性）;反向间接凝集反应：是将已知抗体吸附到载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲种胎儿蛋白（AFP）协助诊断乙型肝炎和原发性肝癌。 3. 协同凝集试验(COAG) 葡萄球菌A蛋白(SPA) 能与多种动物IgG分子的Fc片结合，结合后保持其抗体活性，当与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。;（二）沉淀试验 可溶性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的白色沉淀物称为沉淀反应(precipitation)。 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等。 1.环状沉淀试验 在内径为2-3mm的小试管底部先加入已知抗血清，然后沿试管壁缓缓加入已适当稀释的待测抗原于血清层上，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。用于法医的血迹鉴定、昆虫吸血性测定、炭疽病的诊断等。 ;2.琼脂扩散试验 琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。 用琼脂制成固体的凝胶，使抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇形成肉眼可见的沉淀物，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，称为琼脂扩散。;双向双扩散：即用1％琼脂浇成厚2-3mm的凝胶板，在其上打圆孔，是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。 用8% Nacl溶液制1%琼脂糖平板，打孔（孔径6 mm周边与中心孔距3 mm）。;3.对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis) 原理 抗原在碱性溶液(pH8．2)中带负电荷，在电场中向正极移动，而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极泳动。将抗体置正极端，抗原置负极端，电泳时抗原抗体相向泳动，在两孔之间形成沉淀带。 琼脂凝胶制备 选用优质琼脂（或琼脂糖），浓度为1％-2％，pH通常用pH8.2-8.6的巴比妥缓冲液，离子强度为0.025-0.075mol／L，并加0.01％硫柳汞作防腐剂。;极-;试验操作 制备琼脂凝胶玻板、打孔，挑去孔内琼脂后，将抗原置负极一侧孔内，抗血清置正极侧孔。加样后电泳30-90min观察结果。 本法优点 a.敏感 较双扩散敏感10-16倍； b.快速 仅需1h左右，大大缩短了沉淀带出现的时间。 c.用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测，口