第一章 基因工程(二).ppt

第一章 基因工程Gene Engineering;学习要求;三、目的基因 (一)定义P37 ;(三)获得目的基因的途径;用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。;2、PCR扩增目的基因(Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应) 前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。 PCR技术是基因扩增技术的一次重大革新----1985年美国Cetus 公司的Mullis等研制，于1993年获诺贝尔化学奖。 ;2.1 PCR的原理 PCR技术的原理并不复杂，实质为体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物的四种dNTPs，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的DNA互补链。 PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNA片段，并能很容易地使微微克(pg)水平的起始物达到微克(μg)水平的量。 现已发展成为生命科学实验室获取某一目的DNA片段的常规技术，并逐渐被应用于各个领域。 ;怎样实现DNA的扩增？;20-35 cycles;;2.2 PCR反应体系;灵敏度高 PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。 ;特异性强 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性,同时尽可能减少非特异性扩增。 ;简便、快速、重复性好 一次性加好PCR反应体系，2-4小时完成扩增。 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗提DNA。 ;引物二聚体;3、目的基因的化学合成 实际上是DNA片断的化学合成，不同的是组成基因的DNA 片段一般比较长，是将化学合成的200bpDNA片段采用全 片段酶促连接法等组装成为含完整目的基因的DNA片段。 步骤：①保护dNTP的5’-P或3’-OH ②带保护的单核苷酸连接 ③用酸或碱脱保护 ④DNA片断的连接重组，采用DNA片段的连接酶有E.coli DNA 、T4DNA连接酶;合成过程;4. 机械切割法;5、构建基因组文库分离目的基因 ①含义 基因组文库(genomic library)是生物体基因组DNA经过核酸内切限制酶作部分消化切割之后，克隆在适当的载体分子上，然后重组子转化给宿主细胞，于是便构成了包含该生物体整个基因组全部遗传信息的基因组文库。 ;②涉及到DNA的提取 利用液氮或其他方法对组织进行破碎。细胞提取液中含有的SDS或CTAB溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 全基因组的DNA来源：不同器官、组织。; curcin基因的总DNA分离 Electropherogram of isolated fragment from total DNA of leaves ;③载体 构建基因组文库(genomic library)的克隆载体： λ噬菌体载体、cosmid载体、BAC载体、BIBAC载体、PAC载体和YAC载体等。 ;转 录;————————————AATAAA——GT———— ————————————TTATTT—— CA ————;2.cDNA(complementary DNA):指由mRNA通过逆转录酶进行反转录而成的DNA。 ; 3.cDNA(complementary DNA)文库：将纯化的某种生物的特定发育阶段或组织的mRNA，经逆(反)转录酶作用合成双链的DNA群体，同适当的载体分子重组之后转化给寄主菌株，如此便构成了特定的cDNA文库。这种文库与基因组文库不同，它只包括特定的发育阶段特定组织或器官中表达的基因，而不是全部的基因。 ;提取程序 用具的处理----异硫氰酸胍变性液 4mol/L ----- NaAc(pH4) 2mol/L－－苯酚－－氯仿抽提----收集水相----无水乙醇沉淀－－ LiCl 4mol/L ----冰浴－－沉淀中加氯仿－－无水乙醇沉淀－－70％乙醇洗－－风干－－DEPC水溶解－－－80度保存;;②基本过程 首先构建： cDNA克隆基本过程的是通过一系列的酶催作用，使总mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内，以构成了包含产所有基因编码的cDNA基因文库( cDNA library) 。 ;再从cDNA基因文库中获得目的基因： 根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：用已知的核苷酸序列制成核酸探针，对cDNA基因文库的一系列克隆子进行杂交，能杂交的克隆子就含有