广西猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5、ORF6和ORF7基因的克隆、序列分析及分子流行病学调查研讨.pdfVIP

猪传染瘸 克隆、序列分析及分子流行病学调套研究 陈樱1，黄伟坚“2，罗廷荣“，刘芳。，滠荣辉“’，陆芹章“2，廖素环1 (I．广西大学动物科学技术学院，旷西南宁530005；2．广西大学动物痰病防治研究所。广西南宁。530005) 特异性引物．利用RT-PCR方法从广西遥检病料中检测到12份阳性痛料(包S-it液、流产死胎、肺门淋巴 MLV、MLV 已发表的毒株和疫苗株(MLV、RespPRRS 97．3％、 78．2jl、 苷酸分别为62．264．Ojl、68．268．8jl、65．667．5jI，氨基酸同源性分别为55．756．2％、75．9 株与美国准种变异代表株B2索缘关系较近，其他毒株与HB_2抹的素蝽美承较近．推导ORF5基因编码氨基 酸序列分析发现，12个毒株与疫苗株无相关，均源自野毒株；除G列x外，其余11株均具有病毒亚群特征； 主要抗原表位发生变异，以胞外区(27—4laa)变异较为明显． 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒：基因克隆；序列分析；分子漉行病学 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and reproductiverespiratorysyndrome，PRRS)由病毒引起 猪的一种繁殖障碍和呼吸道的传染病，以母猪发热、厌食、流产、胎儿千尸化、产弱仔等繁 殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征【l】。1987年PRRS首次在美国暴发【2】。迄今为止已经将近 20年，PRRS的持续感染、潜在感染以及目前出现PCV-2、HCV、PRV等病毒的混合感染， 给养猪业带来了巨大的经济损失，已成为困扰当前养猪业健康发展的主要问题之一。 目前，PRRS几乎在整个广西都有发生。很多猪场反应疫苗免疫效果不佳或不确实，而 自家灭活苗的效果较好。一个重要的原因可能是广西PRRS流行毒株发生了广泛的变异。许 多资料表明，ORF5基因是不同毒株之间的变异最大，也是分子流行病学调查最佳基因，而 主要结构蛋白，决定着病毒的免疫原性及大部分生物活性。本研究依据这些特点，以病毒基 冈序列为切入点，着眼病毒的遗传演化变异研究，利用RT-PCR方法扩增和克隆了这3个全 基因，从核苷酸和氨基酸水平分析了广西流行毒株与国内外毒株以及广西流行毒株之间的在 时间上和地域上的遗传变异规律、变异幅度和变异范围．为广西pRRS的防制提供一定的参 考依据。 l材料和方法 1．1材料 室检PRRS的疑似PRRS材料肺脏、淋巴结、肾脏、精液和血清共30多份。引物为本实验 8-T载体为大连Takara公司产品。大肠杆菌DH5a由本实 室设计，由上海生工合成。pMDI DNA mMol／L)购自上海生 验室保存。TRlZOL、Taqpolymerase(5u／pL)和dNTP(各10 工；M-MuLVReverse 美生物工程公司产品：限制性内切酶HindHI、EcoRI购自Takara公司；胶纯化回收试剂盒 购自上海华舜生物公司。 1．2阳性材料的鉴定 与参考文献n方法一致。 第六鏖壤摹会第二次会议■教掌专业娄员会2006年会议论文集 1．3引物设计 基因。为方便目的基因定向插入原核表达载体PET-32a中，在上游5’端引入BamHI酶切位 点，下游引物的5’端引入HindIII酶切位点。引物如下。 El 3’ 5’GCGGATCCCCATCCTACTGGCAATTTGAA E25’GCAAGCTTATCATGGCAAAAGTCGTCTAG3’ Ml5’GCGGATCCAACCAGAGll’TCAGCGGAACA3’ M2 3’ 5’GCAAGCllTCtIKGCTGCTTGCCGTTGT Nl5’GCGGATCCAAGCTG下r．AAACAGG