实验三_氨基酸的纸层析.pptVIP

层析技术原理 实验三 氨基酸的纸层析 一、目的 1. 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法. 2.掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定）. 二、原理 根据液-液分配色谱的原理，氨基酸样品各组分在固定的水相和移动的溶剂相之间反复进行分配，从而把各组分分开。 纸层析属于分配层析的一种，以滤纸作为支持物。滤纸作为一种多孔物质，又由于其本身纤维素和水有较强的亲和力（纤维素上的羟基与水以氢键相连），可以吸附很多水分（一般达滤纸重的22%左右），使水的扩散作用降低便形成静止相（极性）。有机溶剂与纤维素亲和力很弱，可以在滤纸的毛细血管中自由流动，便形成流动相。 由于各物质的分配系数不同则在两相间的分配数量不同。所以移动的速度不同。分配层析就是利用各种物质的分配系数不同而达到分离目的。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中所具有的浓度之比。 溶质在固定相中的浓度 分配系数=——————————— 溶质在流动相中的浓度 在恒定条件（如层析溶剂、展层温度、pH值等）下，分配系数是一个常数。层析溶剂一般选用水和有机溶剂组成。 　三、实验材料、仪器和试剂 　仪器 层析缸及一套培养皿 吹风机 喉头喷雾器 白手套一副 层析滤纸（新华1号）：14cm×22cm 小烧杯 玻璃漏斗及漏斗架 微量注射器或毛细管 分析天平 　　试剂 标准氨基酸溶液：组氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、用10%异丙醇配制，浓度分别为0.01mol/L； 显色剂：0.25%的水合茚三酮丙酮溶液； 展层剂：甲酸：正丁醇：水=3：1.5：2（V：V） 　操作步骤 样品提取 　 称取材料2.5-3.0g，研碎，加入5－10mL80%乙醇，过滤，取上清液备用。 滤纸准备 　 用铅笔在距滤纸底部边1.5cm处轻轻画一横线，在此横线上分出5个等距的点，在点下分别标出应当点的样品的名称。 点样 　 用毛细管点样，每个样点约4μL。每点一次用吹风机吹干或自然干燥后，再点第二（重复4-5次）。 点好样后，用线将滤纸卷成筒状，悬挂在层析缸中，平衡30min，层析缸密封。 以上两步骤需戴手套，以免污染滤纸。 层析 　 将平衡好的滤纸，放入层析缸底部接触展层剂液面，展层剂不可浸没样点，展层剂到达滤纸顶部边缘约0.5cm处停止层析（层析时间2h左右）。然后取出层析滤纸，标好前沿，放入烘箱中45℃烘干。 显色 　 将烘干的滤纸喷洒茚三酮溶液，一定要喷均匀，不要过多。放入60-65℃烘箱中烘干，即可看见氨基酸斑点。 计算 根据各谱点在滤纸上的移动速率Rf值来判断样品中可能含有的氨基酸种类。 原点到层析点中心的距离X Rf =———————————— 原点到溶剂前沿的距离Y 注意事项 (1) 吸样后的毛细管要垂直落在层析纸点样处，样点大小要基本一致； (2) 样点不要浸在展开剂中； (3) 喷显色剂时，使层析纸湿润即可，切勿流淌，并迅速吹干； (4) 在层析纸制作、点样、显色、吹干及Rf值测定等操作过程中，手只能拿在最上端，以防被手沾污。 思考题 (1)层析纸上的样品斑点浸在展开剂中是否可以？为什么？ (2) 悬挂层析纸为什么不能接触层析缸壁？ 不可以。因展开剂会稀释、溶解样品，或使样品斑点严重扩散。 以免瓶壁上带有的展开剂或其他杂质影响展开过程而使Rf值重现性不好。 * * ?层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析,都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相(固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 ?混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,Kd）来描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。 ?物质在层析系统中的行为并不直接决定于其Kd，而取决于它的有效分配系数Keff : ? Keff = ? 某一物质在A相中的总量 ? 某一物质在B相中的总量 溶剂前沿 层析点 原点 溶剂前沿 亮 苯丙 缬 脯 赖 *