传染性支气管炎病毒IBVS1基因的真核表达及其免疫原性的初步检测研究.pdfVIP

2004学术年会 传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的真核表达 及其免疫原性的初步检测+ 刘兆球，姜世金，常维山“ 山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018 摘要：为了探讨s1基因在DNA免疫防制传染性支气管炎(1B)中的免疫原性，将IBVZ 株s1基因插入到真核表达载体pcDNA3l／V5．His．TOPO中，构建了真核表达质粒 在CEF细胞中可见有大量s1蛋白表迭。将重组质粒以100tlg／只的剂量肌注免疫SPF雏鸡， 相应抗体的产生，具有特定的免疫原性。 关键词：真核表达质粒；传染性支气管炎病毒s1基因；转染；免疫原性 传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒的代表种，是具有囊膜的单股正链RNA病毒，其S蛋 白是IBV在免疫学上最重要的蛋白，与该病毒的致病性和抗原性有密切关系。该蛋白合成后在病毒 成熟过程中被水解为s1、s2两个片段。仅sl蛋白能诱导保护性免疫”】，诱发产生病毒中和抗体和 血凝抑制抗体。s1蛋白还可使病毒吸附到细胞膜上，通过细胞问的融合传播病毒”】。因此，研究s1 蛋白在IBV疫病防治、遗传进化等方面具有重要意义。 近年来，随着基因免疫在免疫学方面研究的不断深入，核酸疫苗的研制已成为研究的一火热点， 这给象IBV这样血清型多，抗原性变异大，传统疫苗种间交叉保护能力小的病毒性传染病的预防和 控制带来了新的希望。为了更好的探讨IBVSl基因的免疫原性，本实验以IBV Z株s1基因为免疫 基因，构建了真核表达质粒，并对其免疫原性进行了初步研究。 1材料和方法 1．1菌种和质粒 IBV Invitrogen公司。 1．2主要试剂 脂质体试剂盒购自C,-ibco公司。兔抗IBV血清由山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心提供。 1．3引物 根据IBV基因两端设计一对引物，并在上游引物外加Barn I HI酶切位点，下游引物外加nf ’基金项目：山东省优秀中青年科学家奖励基金 edu．cn 料通讯作者：E-mail：wschang@sdau comcn 作者简介：刘兆球(1978一)，男，山东即墨人，山东农业大学，硕士研究生。E-mail：l_zhaoqiu@sina 2004学术年会 5’一AATCTGCAGTCATGCGACGATGTGAGCTA一3’。 1．4含有IBV—S1基因的重组质粒DNA的提取与扩增 将含有IBV—S1基因的莺组质粒转化大肠杆菌DH5a菌株感受态细胞，增殖培养后提取质粒 DNA。以上述质粒DNA为模板，按常规体系进行PCR扩增，程序为95。Clmin，454Clmin，72。C 1min，进行30个循环，72℃延伸10min后，置4℃保存。 1．5真核表达重组质粒的构建 30分钟，然后转化DH5a菌株感受态细胞。挑选阳性质粒，增殖培养后，提取质粒，用BamHI和 Xho I进行双酶切筛选阳性克隆，并将阳性克隆进行DNA序列测定，利用一对上、下游引物和两个 中间引物进行。序列比较在Ge曲a11l(网站(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)进行。 1．6阳性重组质粒转染CEF细胞 1．6．1膳质体包被与转染 用Qiagen试剂盒提取重组质粒，将重组质粒在脂质体(LipofectamineReagent)作用下转染鸡 不含血清的D—MEM，轻轻摇匀，将混合液加到洗涤过的培养皿中，覆盖细胞，在CO：培养箱内37 在转染后24、48、72h各取出1张盖玻片，用冷丙酮固定5．10min，备用。 1．6．2间接免疫荧光染色检测 50％甘油PBS液封片，荧光显微镜下观察结果。 1．7 阳性重组质粒免疫原性的初步检测 1．7．1实验动物免疫 实验组免疫表达IBVSl蛋白的重组质粒DNA