假单胞菌DLLE4尿黑酸降解基因的克隆与功能的初步分析研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四度全国发酵工程学术讨话套论文集 假单胞菌DLL—E4尿黑酸降解基因的 克隆与功能的初步分析 邓海华，曹 慧，李晓丹，王世明，崔中利2，李顺鹏 (南京农业大学生命科学学院微生物学系，农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京210095) 摘要：通过接合转移将质粒pSCl23上的转座子TIl5随机插入到DLL—E4基因组DNA 中，从大约8，000十突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的宪变株M18，该 侧翼序列发现其与已报道的尿黑酸l，2一双加氧酶基固^卅gA的同痹性为92％。将hmgA定 coli 向克隆至表达载体pET一29a中-转化至EscherlchiaBL21，经IPTG诱导后可表达分子量 曲为48kD的蛋白}诱导后转化子租酶液对屎黑醺有很好的降解效果。将hmgA连入自杀性 载体pEXlgGm．通过同源重组整台至M18染色体中，使其恢复了DLL-E4利用Phe的能力， 证契了HragA是屎罴醺革环裂解酶。 关键词：屎黑酸1，2-_飘加氧酶}转座子标签法)SEFA-PCR)同挥重组；基因敲入 引 言 尿黑酸I，2-双加氧酶(homogentlsate 裂解酶，在芳香族氨基酸如苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)代谢过程中催化尿黑酸苯环裂 解生成延胡索酰乙酰乙酸“。]。在大多数假单胞菌中hmgA和hmgB(延胡索酰乙酰乙 究得较多，人体体内代谢尿黑酸的酶先天性缺陷就会导致尿黑酸分解受阻，从而形成尿 黑酸症o“]；但原核生物中HmgA的研究却很有限，其原因可能是作为原核生物的典型 代表——大肠杆菌不能利用Phe和Tyrn】。尿黑酸是多种化合物的中间代谢产物，对 HmgA的研究有助于了解它们代谢途径之间的相互关系及代谢多样性，也为研究原核生 物中1，2·双加氧酶基因的进化趋势和潜在的进化机制提供了条件。 转座子标签法是克隆基因常用的方法，将转座子插入到欲克隆基因的内部或附近相 关基因，利用转座子所携带的标记基因进行突变子的筛选，然后在此基础上进行目的基 因的克隆o]。本文利用转座子标签法突变能以Phe为唯一碳源生长的Pseudomonaspu— tida formed DLL—E4，以SeIfadaptor PCR扩增转座子侧翼序列获得^mgA。通过hm一 基金项目：国家高技术研究发展计划项耳(。863”项目)(No．2004AA246070) 国家自然科学基金资助项目(No40371069) 作者简介：邓海华(1980-)，男，湖南郴州人，硕士研究生，主要从事环境微生物分子生物学研究。 通讯作者：E-realllczl@njau．edu．cN 邓海华等：假单胞苗DLL-FA屎黑酸降解基因的克隆与功能的初步分析 gA在大肠杆菌中的诱导表达及基因敲人试验，证实了^mgA是Phe降解关键酶——尿 黑酸l，2一双加氧酶基因。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株及质粒：Pseudomonas coli putida State University)HerbertP．Schweizer教授馈赠”。 1．1．2酶、试剂和引物：限制性内切酶、T4 品；引物合成和DNA序列测定由上海荚骏生物技术有限公司完成。其它化学试剂均为 分析纯。 0．59， NaCl K2HPq1．59 0．59，MgSol·7H200．29，pH7．2．去离子水定容至1，000mL；含 子水定容至1，000 mLI配制固体培养基时在上述配方中加入15∥L的琼脂。 抗生素用量：氨苄青霉素(Ap)100mg／L，卡