假单胞菌M18 R发酵液中生物农药藤黄绿菌素的分离纯化研究.pdfVIP

第七届全国新农药创制学术交流会论文集 8 假单胞菌M1R发酵液中生物农药藤黄绿菌素的分离纯化 王威秦晓婧卢晖张雪洪许煜泉 (上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢教育部重点实验室，上海，200240) 进行了制备．首先将离心沉淀细胞后的培养液以0．5：1(体积比)的乙酸乙酯提取两次：将提取物通过硅 率为69．8％． 关键词：藤黄绿菌素：硅胶柱层析：制备型：HPLC 1前言 学名称为2，3一二氯-5-[2’，6’一二羟基苯甲酰基]吡咯，其分子结构式如图1．Plt在常温下为黄色晶体， 具有芳香族的气味，紫外吸收峰在310nm左右，微溶于水，易溶于乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂．、 图1Pit的分子结构 Plt具有广谱抗菌活性，能抑制细菌、真菌、除草¨_1，特别是抑制卵菌属真菌，如终极腐霉等啼1，这 些真菌会引起一些作物苗期根部的腐烂。 Pseudomonas 本课题组从上海郊区甜瓜根际土壤中分离获得的一株荧光假单胞菌M18(E]uorescent ppm以上，远远高 M18)，对其进行了NTG诱变和朋叫一突变，得到的M18R菌株的Pit产量可以达到500 于野生菌株。本文对该菌株发酵液的中Plt进行了分离纯化． 1材料和方法 1．1材料 荧光假单胞菌M18R突变株，本实验室保藏。 1．2方法 1．2．1 M18R的培养 L ml摇瓶中，28℃、220 以种龄1lh、接种量5％，将M18R接种在装有1King’B液体培养基的2500 rpm，培养48小时后收获细胞悬浮液。 1．2．2 Plt的分离纯化 首先将发酵液在16℃下，8000 乙酸乙酯进行提取，得到含有Pit的粗提物． 对得到的含有Plt的粗提物进行常压硅胶柱层析，具体条件为：将500 g预先用氯仿饱和的层析硅胶 均匀后，加入上述层析柱，以氯仿做流动相洗脱；每200ml洗脱液分步收集一次，旋转蒸发后，用少量甲 324 第七届全国新农药创制学术交流会论文集 醇溶解，flPLC测定其成分；对有Pit的部分合并，得到Pit粗品． 品后。用孔径为4．5m的微孔膜过滤器过滤；进样量为5ml，检测波长为308nm，以50％甲醇为流动相， 流速为15 ml／min=收集最大峰值时对应的洗脱液，放入旋转蒸发仪中蒸干。得到Pit单体。 1．2．3Pit的测定 column 检测．流速lml／min，ZorbaxC18柱(5、250X4．6mm)，室温检测。 2结果和讨论 2．1发酵液中PIt的粗提 分别取5ml上清液，以乙酸乙酯为提取剂，对发酵液中Pit的提取方法进行了比较，每个条件进行3 次平行实验．结果见表l。 表1发酵液中Pit的提取方法 提取方法 Pit含量(mg／L) 提取次数 乙酸乙醑和细胞悬浮液的体积比 O．5：l 538．7±4．8 提取一次 I：I 597．6±33．9 2：I