第三章_基因克隆1.ppt

遗憾的是这个质粒的分子量较大，拷贝数较低，且只有一个抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。阻碍了该质粒的使用价值 2 重要的大肠杆菌质粒载体pBR322：是F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建的载体 松弛型复制 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆 目前,在基因克隆中广泛使用的pBR322质粒载体,是最早用人工方法构建成功的一种较理想的质粒载体,多年来一直都是质粒载体中的主力军。 pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的 ①来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄西林抗性基因(Ampr） ②来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(Tetr） ③来源于ColE1的派生质粒pMBl的DNA复制起点(ori〉。 pBR322质粒的构建 构建pBR322质粒的第一步是，在体内将R1drdl9质粒的易位子Tn3易位到pMBl质粒上，形成大小为l3.3kb的质粒pMB3。这种体积对作为克隆载体来说仍然是大了一些。 为了缩小pMB3质粒的体积，又要保留它的复制起点、选择记号以及对大肠杆菌素El的免疫性，可在EcoRI＊活性条件下消化pMB3质粒。 所谓EcoRI＊活性，是指在一些特定的体外环境中，此时它不需要5’—GAATTC—3’这段完整的识别序列，而只需要其中的4个核苷酸即5’—AATT—3“核心序列，就能进行切割。由这种切割所产生的EcoRI AATT粘性末端能够重新连接起来形成环状分子。 然后把这些分子导入大肠杆菌，其中只有具质粒复制起点的分子才能成功地转化大肠杆菌细胞。因此这样便可能挑选到失去了EcoRI＊片段的重组体。这样的重组体之一命名为pMB8质粒，分子大小为2.6kb，它仅带有对大肠杆菌素E1免疫性基因及EcoRI单一识别位点，但失去了对氨苄青霉素的抗性。 质粒DNA的迁移作用 (mobilization) 质粒的迁移作用它同接合型质粒的自我转移过程是属于两种不同的概念。接合型质粒的分子比较大，一般在30×106dal以上，编码有一套控制质粒DNA转移的基因。因此，它们能够从一个细胞自我地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。 非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。 非接合质粒 非接合型的质粒(non—conjugative plasmid)，亦叫不能自我转移的质粒。它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因,因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。 在非接合型的质粒中，附加有大肠杆菌素基因的，叫做大肠杆菌素Col质粒；而附加有抗菌素抗性基因的，则叫做大肠杆菌R质粒，也称R因子。 迁移作用 ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。遗传学的研究已经揭示出，ColE1质粒从给体细胞转移到受体细胞的生化过程，需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因(mobilization gene )编码的核酸酶。相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供它所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。 图1表示位于F－细胞中的ColE1质粒的状态，它的mob基因进行了转录，其产物使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA便从超盘旋的结构转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。 bom mob产物 图2中的细胞同时含有F和ColE1两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为其DNA转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而在F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColE1 的mob—突变体便不能够转移。 可转移 　　F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已形成，但ColE1DNA并没有发生缺口。另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能够发生缺口，因此仍然不能够转移。 都不能转移 4 质粒DNA编码的表型 （1）抗性 （2）代谢特征