植物组织培养与器官培养PPT.pptVIP

培养基分类 根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下4类： ①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；-MS ②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5 ③中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H ④低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE 3.1.4 植物组织培养问题分析 3.1.4.1试管苗玻璃化现象（vitrification） 是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。 玻璃化苗绝大多数为 来自茎尖或茎段 培养物的不定芽。 通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低， 在继代培养中仍然 形成玻璃化苗。 玻璃化的解决方法 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； 减少培养基中NH4+浓度； 增加光照； 增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生； 降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。 3.1.4.2 褐变问题 成因 酶促----酚氧化成醌及聚合 非酶促----醌聚合 时段 初代培养 继代培养 ① 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 ② 合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 ③ 使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 ④ 材料预处理和细胞筛选 ⑤ 使用吸附剂 0.1%-0.5%的活性炭、PVP对防止褐变也有较为明显的效果。 ⑥ 连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。 减轻褐变现象发生的方法 3.1.4.3 微生物污染问题 原因 消毒不彻底 外植体消毒问题 培养基及器皿消毒问题 环境消毒问题 无菌操作不过关 外植体消毒问题 外植体取材 外植体(expant)是指用于离体培养的活的植物组织。 来源： 外植体消毒问题 外植体灭菌的过程： 流水冲洗10~20min 表面消毒 无菌水冲洗4~5次 沥水待用 Flash 常用消毒剂消毒灭菌效果比较 消毒剂 使用浓度% 去除的难易 消毒时间min 效果 次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉 溴水 过氧化氢 升汞 酒精 抗生素 硝酸银 9~10 2 饱和溶液 1~2 10~12 0.1~1 70~75 4~5(mg/L) 1 易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难 5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30 很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好 容器容积（mL） 121℃下所需的最少灭菌时间(min） 20~50 75 250~500 1000 1500 2000 15 20 25 30 35 40 培养基及器皿消毒灭菌问题 培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间 培养基灭菌 培养基组成中若含有遇热易分解物质，如 生长调节物质、维生素、尿素、酶等，则必须用过滤法除菌。 过滤除菌时，使用孔径为0.22~0.45μm或更小的细菌滤膜。 过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，灭菌温度不超过121℃。 器皿消毒灭菌 手术刀 镊子 平皿 干热灭菌 150-160℃，2h 环境消毒问题 无菌操作问题评价下列操作正确与否 评价下列操作正确与否 评价下列操作正确与否 评价下列操作正确与否 无菌操作 无菌操作前的准备工作 无菌操作台的使用 操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。 无菌操作步骤 外植体的适当切割的注意事项 继代培养的材料(液体材料、固体材料） 3.1.4.4 其他问题 培养条件控制 激素水平 光照：时间，强度和光质。 温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生。 pH 通常使用的pH值的范围是5.5－6.5。pH4或7，培养物不能正常生长。 气体 激素水平的控制 生长素应用的浓度范围为0.1~15mg/L。 在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以2,4-D最为有效。 细胞脱分化需要高浓度的2,4-D，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。 使用浓度范围为0.1~10mg/L。 细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。 16h/d 24h/d 0h/d 光照时间的影响 液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关