人己糖胺酶D的原核表达纯化及酶学特性研究.PDFVIP

中国生物工程杂志 China Biotechnology ，20 12 ，32 (9):28-33 * D 、 人己糖胺酶 的原核表达 纯化及酶学特性研究 1 2 3 2 1 ＊＊ 刘 琳 徐  蔡春梅 李 静 蔡玉梅 (1 山东农业大学动物科技学院 泰安 27 10 18) (2 南开大学药学院药物化学生物学国家重点实验室天津市分子药物研究重点实验室 天津 30007 1) (3 德州市第二人民医院 德州 253024 ) ， 、 摘要 糖基化修饰是一种重要 的蛋白质翻译后修饰 参与生物体中 的信号传导 细胞识别等 多种 ， 。 D ( Hexosaminidase D) 细胞活动 糖基缀合物的正常水解是生物体代谢 的必需途径 人 己糖胺酶 GalNAc ， 是新发现的一种存在 于人 细胞质 中的切 除 糖基化修饰 的外切酶 但该酶的酶 学特性 尚不 。 PCR ， Hex D cDNA pET3C ， 清楚 利用 的方法 将 的 序 列构建到质粒 中 重组质粒 转化 大肠杆菌 BL21( DE3) plysS ， - -D- ( IPTG) ( 0 ． 1 mmol / L) 后 通过优化异 丙基 β 硫代吡喃半乳糖苷 浓度 和诱导 时间( 10 h) 获得了高可溶性表达的重组蛋白酶 。采用 Ni-NTA 亲和层析对重组蛋白进行了纯化 ， SDS( 58 kDa) ( 95% ) 。 4 - -2- -2- 检测分子量的大小 和纯度 以上 以 甲基伞形 酮 乙酰氨基 脱氧 ( 4 -MU-O-GalNAc) ， pH 5 ． 5 ， 37 ℃ ， 半乳糖 为荧光底物 测定该酶的最适反应 值 为 最适反应温度为 ， 50 ℃ ，1mmol / L ( CuSO 、FeSO 且该酶的热稳定性较好 在 下放置半小时仍有较 高活性 的金属 离子 4 4 ·7H O 、MgCl ·6H O 、CaCl 、NiSO ·6H O 、AlCl ·6H O 、ZnSO ·7H O 、MnCl ) 及 EDTA 对该酶 2 2 2 2 4 2 3 2