人载脂蛋白AV原核表达载体的构建与纯化研究.PDFVIP

DOI：10．3969／j．issn．1007-5062．2013．04．031 ·基础研究· 人载脂蛋白AV原核表达载体的构建与纯化研究 李国平 隋靖苗 毕楠 满永 王抒 陈保生 黎健 [摘要] 目的：构建人载脂蛋白AV(apolipoproteinAV，apoAV)的原核载体并表达纯化该蛋白。 方法：从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA，以反转录的cDNA第一链为模板，经聚合酶链式反应 (PCR)扩增得到含有编码apoAV完整成熟肽段的PCR片段。PCR产物和原核表达载体pET30b经核酸 内切酶双切后连接，连接产物经转化至大肠杆菌感受态细胞Topl0，挑选克隆测序。重组质粒pET30b- apoAV转化大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，并优化诱导表达条 件，重组的apoAV经镍离子螯合树脂纯化获得。结果：经测序证实人apoAV目的基因成功克隆人 pET30b原核表达载体中，经过IPTG诱导有约40KD的特异性蛋白表达，与预期大小一致。该蛋白在 IPTG诱导下的最佳表达时间为5h，最佳浓度在31．3 I山mol／L。纯化的apoAV纯度在95％以上，产率约 为15mr／L。结论：成功构建人apoAV的原核表达载体，实现了高效表达和纯化，为进一步研究其结构 与功能奠定了基础。 [关键词]载脂蛋白AV；原核表达；蛋白纯化 [中图分类号]R54[文献标识码]A [文章编号]1007-5062(2013)04-499-04 human vector Constructionof AV and ofthe H apolipoproteinprokaryotic purificationtargetprotein The Shu，CHEN Jian of Guoping，SUIJingzhe，BINan，MANy0增，WANG Baosheng，LI KeyLaboratory Institute Geriatrics，Be历ngofGeriatrics，BeringHospital，MinistryofHealth，Beijing100730，China constructthe vectorand ofthe [Abstract]Objective：To apolipoproteinAV(apoAV)prokaryoticpurify RNAwasisolatedfromthehuman cellline the targetprotein．Methods：Total hepatoma HepG2，followingby first—strandcDNA mature DNA Was chainreaction fragment synthesis．EncodingapoAV amplifiedbypolymerase PCR were intothe andrecombinantcloneswere (PCR)．Purifieddigestedproductsligated pET30b sequenced． Therecombinant wasinduced E．coliB121 ApoAVprotein byisopropylB—D一1-thiogalactopyranoside(IPTG)in the condition