链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2隐性卤化抗菌肽类编码基因簇的克隆及生物信息学分析.docVIP

精品论文 参考文献 链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2隐性卤化抗菌肽类编码基因簇的克隆及生物信息学分析 遵义医学院 贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室 贵州遵义 563003 摘要：利用第二代技术对分离自贵州梵净山的链霉菌分离菌株Streptomyces sp.FJS31-2进行基因组测序，测序结果组装后利用相应生物信息学软件进行分析，从中预测出1个卤化肽类生物合成基因簇，为相应产物的开发提供了理论依据和物质基础。 关键词：链霉菌；隐性基因簇；抗菌肽；克隆 1 前言 微生物来源的肽类肽类抗生素具有多种生物活性并具有很强的临床应用价值或潜力，近年来引起很多研究者的关注，并分离得到多种活性抗菌肽类化合物如：抗结核分枝杆菌的紫霉素、结核放线菌素、卷曲霉素，抗革兰氏阴性菌的多黏菌素B、黏菌素等，抗革兰氏阳性菌杆菌肽，抗耐甲氧西林金葡菌万古霉素、太古霉素、替考拉宁等，抗真菌沙拉霉素以及抗病毒的端霉素[1-5]。 近年来的微生物基因组研究结果表明，微生物来源的肽类抗生素往往是由其基因组上成簇排列的刺激带线基因簇编码的相关基因参与合成的，但由于培养条件等众多因素的影响，很多情况这些基因簇往往是以不表达的沉默形式村存在，基因簇的克隆及功能的预测可为这些基因簇的激活及异源表达及组合生物合成提供重要信息[6]。 2.材料与方法 2.1实验菌株 链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2分离自贵州梵净山海拔1000 m土壤样品，其次级代谢相关基因筛选为卤化酶、非核糖体肽合成酶、I型聚酮合酶和II型聚酮合酶阳性，III型聚酮合酶阴性。菌株发酵产物具有抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及白色念珠菌等测试菌活性。 2.2链霉菌基因组测序策略 采取shotgun测序策略，利用用高通量Illumina测序技术对该样品的DNA进行paired-end测序，构建了500 bp的文库，期望数据量为1000 Mb。整个测序流程包括：基因组DNA获取、基因组DNA片段化及回收、测序文库构建、桥式PCR扩增、Illumina Hiseq 2000测序等。 2.3 链霉菌基因组测序原始结果处理 [7] 基因组组装利用SOAP de novo v2.04（http：///）拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果。其次，运用GapCloser v1.12软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。测序产生的序列数据的信息分析流程的具体步骤包括：测序数据过滤、de novo组装及组装后的评价、基因预测（ORFs）、基因功能的注释（KEGG/COG）。 2.4次级代谢基因簇分析 [8] 利用在线预测工具antiSMASH（http：//antiSMASH.）在线预测分析3株链霉菌可能包含的次级代谢基因簇。主要流程包括：大片段DNA序列系统进化谱相似性检测（Detecting smCOGs for contig）和基于大片段次级代谢蛋白功能相似性比对分析的次级代谢基因簇预测（ClusterBlast analysis for contig）等步骤。按照基因簇结构基因与同源基因的氨基酸残基的最大相似性预测同源基因簇。 3.结果与分析 对S.sp.FJS31-2基因组扫描，预测到1个可能编码新的卤化短肽类的基因簇（图1），该基因簇主要由7个读框方向一致的骨架合成基因和后修饰基因组成。此外，其上游可能还有系列调控蛋白和转运蛋白涉及到产物的合成调控、转运及耐药等。这些基因编码的蛋白中，包括4个转运相关蛋白（GLUD、GLUC、GLUA和GlnH），3个调控相关蛋白（Transcriptional regulator OmpR、Two-component system sensor kinase SasA和TAXI family TRAP transporter solute receptor），3个骨架合成相关蛋白（Tyrocidine synthase 3，Clavaminate synthase-like protein 和Siderophore biosynthesis protein SbnA）以及3个后修饰相关蛋白（Siderophore biosynthesis protein SbnA，Tryptophan 2-halogenase和Protein MbtH）。目前，在数据库中尚未搜索到该基因簇的同源基因簇。仅在GenBank中搜索一些该基因簇组成基因的同源基因，提示这可能是1个较新的卤化短肽