春高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离课件高中教育精.pptVIP

一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 电泳方法 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 二、凝胶色谱法的操作流程 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 【例2】 下列关于红细胞的洗涤过程的叙述,正确的是(　　) A.低速长时间离心,如500 r/min,12 min,以保证达到很好的分离效果 B.离心后用胶头吸管吸出下层透明的红色血浆 C.将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的蒸馏水 D.直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净 解析：红细胞洗涤过程中,应做低速短时间离心,以避免白细胞、淋巴细胞等一同沉淀,影响血红蛋白的提纯;离心后血浆在上层,并呈现为黄色,需用胶头吸管吸出;洗涤红细胞时应用生理盐水而不用蒸馏水,否则,将导致红细胞破裂影响实验结果。因此A、B、C均错误。 答案：D 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 大吉大利 打击到吗试试 目标导航 预习导引 目标导航 预习导引 一 二 一、分离蛋白质的原理与方法 1.分离蛋白质的原理 2.分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,也叫分配色谱法。 目标导航 预习导引 一 二 ②过程及原理 b.分离的过程 目标导航 预习导引 一 二 c.分离原理:依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。 (2)电泳法 ①电泳的概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 ②原理:利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同,使带电分子在电场中产生不同的迁移速度,从而分离样品中的各种分子。 ③分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质-SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。 3.缓冲溶液 (1)组成:通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例,可配制不同pH的缓冲液。 (2)作用:抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。 目标导航 预习导引 一 二 缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对,每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对,你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗? 提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有:H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。 目标导航 预习导引 一 二 二、凝胶色谱法的实验操作 1.蛋白质的提取和分离步骤 (1)样品处理 血红蛋白的释放:红细胞在蒸馏水和甲苯作用下破裂,释放出血红蛋白 分离血红蛋白溶液:混合液离心→过滤去除脂溶性沉淀层→用分液漏斗分离 目标导航 预习导引 一 二 (3)纯化:凝胶色谱法。 (4)纯度鉴定:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 目标导航 预习导引 一 二 2.凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填。 固定:将色谱柱垂直固定在支架上 ↓ 装填:将用蒸馏水充分溶胀后的凝胶配成凝胶悬浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时可轻轻敲动色谱柱,使凝胶装填均匀 ↓ 洗脱:装填完后,立即用缓冲液洗脱瓶,在约50 cm高的操作压下,用300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12 h? 目标导航 预习导引 一 二 (3)样品的加入与洗脱。 ①加样前:打开下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。 ②加透析样品。 调整缓冲液面:与凝胶面平齐 ↓ 滴加透析样品:用吸管将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端 ↓ 样品渗入凝胶床:加样后,打开下端出口,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口 ↓ 洗脱:打开下端出口,用 20 mmol/L的磷酸缓冲液洗脱? 目标导航 预习导引 一 二 ↓ 收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5 mL收集一管,连续收集? 3.操作提示 (1)红细胞的洗涤:洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离效果。 (2)色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。 (3)凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低