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医学论文-基因芯片技术检测利福平药物诱导 H37Rv株基因突变的应用研究 【摘要】? 目的用利福平、异烟肼药物作用 H37Rv 株，诱导基因突变，用基因芯片技术检测耐药菌株突变基因位点。 方法 H37Rv 菌株用不同浓度的利福平和异烟肼加入培养液中观察菌株的耐药生长情况，耐药菌株用 PCR 扩增产物杂交，基因芯片检测药物作用部位是否有突变，检测突变基因位点。 结果利福平药物诱导H37Rv耐药，用基因芯片技术检测利福平耐药菌株，rpoB 基因 531 位发生突变，TCG 转变为 TTG，直接测序发现在相同 位点发生突变。耐异烟肼耐药菌株 katG 基因 315 位发生突变，AGC 转变为 ACC。同时加入两种药物的耐药株用基因芯片检测分别在 rpoB 基因 531位，katG 基因 315 位发生突变。结论结核分枝杆菌产生耐药的机理与药物作用基因位点突变有关。基因芯片检测技术耐药菌株基因突变，不仅可以准确地确定突变位点和突变类型，快速、高效、设备简单，并能同时检测分析成千上万个基因有关突变位点。 【关键词】? H37Rv 株；药物诱导耐药；DNA 芯片；突变基因 我国是世界上结核病发病率最高的 22 个国家之一，肺结核患者约有 600 万人，每年约有 25 万人死亡。世界卫生组织报警：肺结核日夺全球千人性命，在西太平洋地区每日有近 1 000 人死于肺结核，将削弱地区的经济增长，肺结核大部分患者年龄在 15 岁至 54 岁之间，是社会的主要劳动力。如果作为家庭经济支柱，经济有重要影响，在孟加拉国每 2 min 就有 1 人感染肺结核，每 10 min 就有 1 人死于结核病。结核病严重危害人类健康及经济的发展。结核病流行显示高患病率、高耐药率、低速降率等特点[1]，特别是抗结核药物的广泛应用及不合理的服药，结核杆菌产生高耐药，临床检测困难，耐药菌株存在作为传染源，对流行病的控制带来严重威胁。快速检测那部分耐药菌株，可为临床诊断治疗提供可靠的依据。为了消除传染源，控制结核病的流行，我们用利福平等药物作用于结核菌，用基因芯片技术检测耐药菌株的基因变化，有快速高效的应用效果，现报道如下。 ??? 1??? 材料和方法 ??? 1.1??? 材料和仪器 ??? 1.1.1??? 全自动血培养仪??? Esp c?? lture systemⅡ?? ??? 1.1.2??? 结核菌培养液??? Esp myco 培养瓶，12.5 mL/ 瓶，美国 TREK Diagnostic systems Inc 生产。 ??? 1.1.3??? 生物安全柜??? Fx1200-Ⅱ-A/B，上海瑞仰净化设备有限公司。 ??? 1.1.4??? 煮沸箱。 ??? 1.1.5??? Lightcycler 荧光 PCR 仪。 ??? 1.1.6??? Generalscanning 芯片信息系统 Scannarray 3000 扫描仪。 ??? 1.1.7??? 基因芯片??? 由中科院上海信息系统和微技术研究所，宁波瑞芯生物科技有限公司生产。 ??? 1.1.8??? 引物??? 正向 CAG GAC GTG GAG GCG ATC 18 bp；反向 C GCT CAC GTG ACA GAC CG 18 bp；由上海生工工程技术服务有限公司合成。 ??? 1.1.9???? H37Rv 菌株购自中国药品生物制品检定所 ??? 1.1.10??? 利福平﹑异烟肼医院购买。 ??? 1.2??? 方法 ??? 用利福平﹑异烟肼药物诱导作用 H37Rv 菌株。 ??? 1.2.1??? H37Rv 菌株在无菌生物柜中打开，用无菌生理盐水稀释，抽取 0.5 mL 接种。Esp myco 培养基中置 Esp culture system Ⅱ 培养仪培养，3 周后见细菌生长，继续培养 1 周后取培养液 0.5 mL 分别接种于 Esp myco 培养基中，置培养仪培养，培养 2 周后见各瓶有细菌生长。 ??? 1.2.2??? 用利福平加入培养悬液中诱导作用于细菌。利福平 0.15 g/粒，用无菌生理盐水 10 mL 溶解呈 150 mg/10 mL，抽取 1 mL=15 mg/mL 利福平加 9 mL 生理盐水，即呈 1.5 mg/mL，即 1 500?? g/mL 利福平。 ??? 1.2.3??? 取 1 500?? g/mL 利福平 2 mL 加入培养液中，浓度呈 240?? g/mL 利福平。取 1 500?? g/mL 利福平 0.4 mL 加入培养液中，浓度呈 48?? g/mL 利福平。取 1 500?? g/mL 利福平 0.4 mL 加入培养液中，浓度呈 4.8?? g/mL 利福平。依据 WHO 公布的标准：细菌在含 40~50?? g/