微生物检测平板菌落计数法.docVIP

*************公司·品管部 微生物检测平板菌落计数法 文件编号 QS/TH-ZY-PG-401 版 本 A0 实施日期 2010年10月3日 1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品平板菌落计数的方法。 本标准适用于各种出口食品及其原料,有专门规定检验方法的除外。2 设备和材料2.1 工作台：超净工作台或放于清洁、光线充足的实验室里的水平工作台。琼脂平板在 工作台上暴露15 min,每平板不得超过15个菌落。2.2 恒温培养箱：36±1℃。2.3 恒温水浴箱：45±1℃。 2.4 均质器。2.5 振荡器。2.6 吸管：1、10和25mL,具0.1mL刻度。2.7 平皿：直径为90 mm。2.8 稀释瓶：广口瓶或三角烧瓶,容量为200 mL和500 mL。2.9 玻璃珠：直径为5mm左右。2.10 天平：感量0.1g。3 培养基和试剂3.1 平板计数琼脂。3.2 75％乙醇。3.3 稀释剂：磷酸盐缓冲稀释液。4 操作程序4.1 样品制备4.1.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内,如有包装,则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。4.1.2 制备样品匀液4.1.2.1 固体或半固体食品：以无菌操作取25 g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10的样品匀液。如样品均质时间超过2min,应在均质杯外加冰水冷却。4.1.2.2 干燥或干粉食品：以无菌操作取25 g样品,放入装有225mL稀释剂和适量玻璃珠的500 mL稀释瓶中。迅速振摇,将样品混匀,制成1 : 10的样品匀液。振摇时,幅度为30cm,7s内振摇25次,也可用机械振荡器振荡15s代替手摇。4.1.2.3 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品, 放入装有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中,按4.1.2.2条中所述方法迅速振摇,制成1:10的样品匀液。吸取样品时,吸管插入液面下不要超过2.5cm。吸管内液体要在2～4s内完全排入稀释剂中。不要在稀释剂中吹洗吸管。 4.2 稀释样品匀液 4.2.1 用10 mL灭菌吸管准确吸取1:10的样品匀液10 mL,放入装有90 mL稀释剂的200 mL, 稀释瓶中。按4.1.2.2条中所述的方法,迅速振摇。制成1:100的样品液。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中,吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度,然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度 4.2.2 分别用10mL灭菌吸管按4.2.1条所述方法将样品匀液制成10倍递增稀释的样品液,如10**-3、10**-4、10**-5……。 4.3 平板接种 4.3.1 对于每一个样品,选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。 4.3.2 分别用灭菌吸管吸取1mL样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过3 min,应按4.1.2.2条所述方法再振摇该样品液。4.3.3 分别加12～15mL平板计数琼脂(已放45＋1℃的水浴中恒温)到各平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合方法是将平皿倾斜和旋转。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1 mL稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基,每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。 4.4 培养 待琼脂凝固后将平皿翻转,立即放进36±1℃的恒温培养箱内培养48±2h。培养箱应保持一定的湿度,经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％。 4.5 菌落计数和记录 4.5.1 培养后,立即计数每个平板上的菌落数。25～250个菌落为合适范围。如果不能立即计数,应将平板存放于0～4℃,但不得超过24 h。 4.5.2 如只有一个稀释度的两个平板上的菌落在合适范围内, 先计算两个平板的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)样品中平板菌落数(下表,样品1)。 4.5.3 如有两个稀释度在合适范围内,先计算每个稀释度两个平板的平均值,再计算两个稀释度的平均值,然后计算每克(毫升)样品中平板菌落数(下表,样品2)。 4.5.4 当最低稀释度的两个平板上都少于25个菌落时,计数这一稀释度两个平板上的实际菌落数,计算两个平板上的平均菌落数,将平均菌落数乘以稀释倍数,得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号(*), 表明该数系从菌落数在25～250这一范围之外的平板估计所得(下表,样品3)。 4.5.5 当所有平板上的菌落都超过250时,则应将最高稀释度的两个平板的平均菌落数乘