重组人红细胞生成素制备工艺 课件 .ppt

生物制药工艺学——多肽与蛋白质类药物 重组人红细胞生成素生产工艺 1、种类 重组人红细胞生成素生产工艺 2、临床应用 重组人红细胞生成素生产工艺 4、表达系统 重组人红细胞生成素生产工艺 5、表达载体 重组人红细胞生成素生产工艺 6、构建表达红细胞生成素的细胞株 重组人红细胞生成素生产工艺 重组人红细胞生成素生产工艺 重组人红细胞生成素生产工艺 * 红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对红细胞生成的特异性刺激作用的细胞因子。红细胞生成素是一种糖蛋白，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内主要由肾脏产生。红细胞生成素与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞的特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中释放红细胞。 天然红细胞生成素是以人或动物的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到。目前已知人红细胞生成素有两种存在形式，即人EPO-α及人EPO-β，二者差别在于二者的糖型组成不同，EPO-α含有较多的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，总的含糖量也较EPO-β高。 重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然具有相同的体内、体外活性。 重组红细胞生成素(EPO)是目前临床上治疗慢性肾衰性贫血疗效最显著的生物技术药物，如肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。 成熟的红细胞生成素是由165个氨基酸残基组成的糖蛋白，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳）。红细胞生成素前体带有27个氨基酸的信号肽。红细胞生成素基因存在于7q11-q22区的一个5.4 kb HindⅢ-BamHⅠ性内切酶切片段中。 糖基化红细胞生成素对热和pH变化稳定，等电点为4.2～4.6，未经糖基化肽链等电点pH为9.2。 3、理化性质 Jacob等从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。 Quelle等利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。 重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。 有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。???????将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。 构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。 以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。 7、CHO细胞培养工艺过程 种子细胞制备????? （1）冻存的细胞株37℃水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。????? （2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。????? （3）37℃二氧化碳培养箱培养，连续传三代。????? （4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5×106个/ml。 7、CHO细胞培养工艺过程 反应器连续培养???? （1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。???? （2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速50 r/min，37℃，DO 50%～80%，进行贴壁培养。???? （3）转速提高到80~100 r/min，继续扩增培养10天。 ???? （4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。??? （5）收获培养物，4℃~8℃保存。 8、培养工艺控制 搅拌速度：先慢后快?温度：恒定的温度(37℃) ?pH值：细胞生长与表达的pH值为7