基因工程制药医学课件.ppt

第二章 基因工程技术制药 一、概 述---几个概念 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 基因工程药物分离纯化的一般流程 各种组织细胞破碎方法 细胞混悬液 高速珠磨 培养细胞 冻融裂解 细菌、植物 细胞 研磨 红细胞、 细菌 低渗裂解 细菌、酵母、植物细胞 高压匀浆 细菌、酵母 有机溶剂渗透 细胞浑浊液 超声破碎 组织培养细胞 去垢剂渗透 柔软的动物 组织 手动式匀浆 细菌、酵母 酶溶 大多数动、 植物组织 旋刀式均浆 组织种类 细胞破碎方法 组织种类 细胞破碎方法 分离纯化的技术 分离纯化技术要求： ⑴ 技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； ⑵ 选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数； ⑶ 收率要高； ⑷ 两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤； ⑸ 整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 1. 细胞破碎与固液分离 ⑴ 细胞收集：离心和膜过滤 ⑵ 细胞破碎： 机械法----高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。 非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。 ⑶ 固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜 过滤。 2. 目的产物的分离纯化 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分 为： Ion exchange chromatography （IEC） Reversed phase chromatography （PRC） Hydrophobic interaction chromatography （HIC） Affinity chromatography （AC） 影响产物的回收 微不均一性 决定工艺采用的温度及流程时间 稳定性 决定分离提系及蛋白浓度 溶解性 决定亲和配基 生物特异性 是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体 聚合性 产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制 特殊反应性 与疏水、反相介质结合的程度 疏水性 决定离子交换的种类及条件 等电点 作用 产物特征 产物的主要特性及在分离纯化中的作用 除菌 0.22μm微孔膜过滤 与多聚体分离 凝胶过滤 去除残余的杂蛋白 疏水层析 去除沉淀物及病毒 超滤 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等 阳离子交换层析 进一步去除病毒 40nnm微孔膜过滤 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒 阴离子交换层析 去除细胞、细胞碎片、颗粒型杂质 离心/过滤 目的 方法 基因工程药物生产中常用的分离纯化方法 分离纯化工艺应遵循的原则 ⑴ 具有良好的稳定性和重复性； ⑵ 尽可能减少组成工艺的步骤； ⑶ 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺和设备相适应。 ⑷ 在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量； 分离纯化工艺应遵循的原则 ⑸ 分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性差的产物； ⑹ 工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低； ⑺ 具有较高的安全性 针对不同的产物表达形式采用不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低， 因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵 体； 采用融合性战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的， 拟首先选用亲合层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用 低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI≦5或 pI≧8）的重组蛋白应 首选离子交换法进行分离，这样很容易除去所有的杂蛋白 ； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首 选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白 之间的解离常数应在合适的范围内（10-8~10-4 mol/L）； 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行 分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分 离的； 径向层析是近年