纳米级水溶性壳聚糖配合物的合成及其与DNA的相互作用机理研究.doc

纳米级水溶性壳聚糖配合物的合成及其与DNA相互作用的机理研究 汪庆祥，谢江坤，袁显龙焦奎 （青岛科技大学化学与分子工程学院，青岛266042） 摘要 将壳聚糖用双氧水氧化降解成纳米级水溶性的壳聚糖，表征了其脱乙酰度和平均分子量。合成了含铜低聚壳聚糖配合物(CHTCu)。采用粘度法和电化学法研究了CHTCu与DNA的相互作用。粘度法实验表明配合物的加入能使得DNA的相对粘度增大。电化学实验表明在0.01 mol/L pH=7.0的Tris-HCl 缓冲溶液中，CHTCu在-0.04 V处和-0.36 V处有一对不可逆氧化还原峰。当加入一定量的DNA后，配合物峰电位出现正移和峰电流明显降低，验证了二者之间的嵌插作用模式。在最佳条件下，峰电流的降低值与DNA的浓度在0.001~0.125 g/L 范围内呈良好的线性关系。 关键词 水溶性壳聚糖；DNA；铜配合物 壳聚糖分子中的-OH和-NH2基对金属离子有一定的配位作用，是一种天然螯合剂[1]。人们利用这一性质来分离某些金属离子，处理含重金属离子工业废水等[]。壳聚糖及其改性衍生物的金属离子配位化合物研究在诸多领域都有其应用前景。稀土元素和贵金属元素的壳聚糖配合物具有良好的催化活性[]。过渡金属元素的壳聚糖配合物除具有催化活性外，有些具有抗菌活性和抗癌活性[]，在生物学和医学上具有潜在的应用价值。壳聚糖作为一种基因载体能通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解，完全进入细胞，具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点，引起了大家的重视。 本文首先对壳聚糖进行氧化降解得到水溶性好的低分子量壳聚糖(CHT)，以CHT作为配体了合成Cu(II)配合物并进行了表征，然后采用粘度法、光谱法和电化学方法研究壳聚糖铜配合物与DNA的相互作用，并探讨了它们的作用模式和机理。 1 实验部分 1.1仪器和试剂 Nicolet 170SX型红外光谱仪，美国Nicolet公司；乌式粘度计(粘度系数0.6～0.7)CHI 832电化学分析仪，上海辰华仪器公司；Cary 50 probe紫外-可见分光光度计，澳大利亚Varian公司。 鲱鱼精DNA购自北京经科试剂公司，用紫外光谱检验其纯度，即A260/A280 1.80表示纯度符合DNA与蛋白质完全分离的要求；DNA浓度以核苷酸表示，通过计算DNA在260 nm处吸光度来确定(摩尔吸光系数ε260=6600 mol/L/cm) []。其它用于合成的试剂均为分析纯，通过商业渠道购买。实验用水为二次蒸馏水。 1.2 实验方法 1.2.1水溶性纳米级壳聚糖的合成 本文采用双氧水氧化降解壳聚糖制备水溶性纳米壳聚糖，其制备过程如图1所示。 图1 水溶性壳聚糖合成路线 量取5 mL 36%乙酸加入250 mL锥形瓶，同时加入100 mL水，然后加入5 g壳聚糖振摇至完全溶解后，将溶液转移至三颈烧瓶中，水浴加热至所设温度80 ℃，打开分液漏斗，在搅拌下按设定的用量比R =2 (H2O2与糖单元摩尔比)滴加30% H2O2 6.34 mL。反应2 h时间后停止反应，用2 mol/L NaOH 调节pH值至中性，冷却抽滤，得到水不溶性壳聚糖。滤液在50 ℃以下减压浓缩至20 mL左右，然后加入3倍量乙醇(体积分数) 放置过夜，抽滤，真空干燥，得到水溶性壳聚糖。 1.2.2纳米壳聚糖金属配合物(CHT-M)的制备 准确称取低分子量水溶性壳聚糖0.322 g，溶于适量的去离子水中，滴入20 mL 0.37 g CuAc的溶液，于50 ℃水溶液中搅拌回流1 h，浓缩后，加入丙酮20 mL，析出沉淀，过滤洗涤，干燥后得到粗产物，用无水甲醇进行重结晶，真空干燥后得到粉末状蓝绿色铜盐的配合物。 .2.3壳聚糖脱乙酰度及平均分子量的计算 采用酸碱滴定[6]和一点法（MarkHouwink方程）[7]分别计算得到的水溶性产物的脱乙酰度及平均分子量。 .2.4 DNA结合实验 .2.4.1紫外可见光谱实验 取一定量CHTCu于比色管中，加入2 mL 0.2 mol/L Tris-HCL缓冲溶液和1 mL 0.1 g/LDNA溶液摇匀反应10 min，然后以相同量的DNA做空白，在200-400 nm处进行电子吸收光谱扫描。 .2.4.2 粘度法 测定粘度时，将温度恒定在(30+0.1)oC。测试液相对粘度按下列公式计算[8]： η=(t - t0)/ t0 其中t0为缓冲溶液流经毛细管所需的时间，t为DNA溶液(含浓度不等的配合物)流经毛细管所需的时间。η0为未加配合物时DNA溶液的相对粘度，以(η/η0)1/3对加入配合物的浓度作图，可以观察到配合物对DNA相对粘度的影响。 .2.4.3电化学法 电极预处理：先用金相砂纸将玻碳电极打磨平滑，再在麂皮上用0.