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张晓静 2009.09 张晓静 2009.09 第二章 酶分析法 第一节 酶活力测定法 第二节 酶法分析 酶分析法的两种类型 酶活力测定：以酶为分析对象，也就是根据需要对样品进行酶含量或活力的测定。 酶法分析：以酶作为分析工具或分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难以检测的物质，这些物质可以是酶的底物，也可以是酶的抑制剂或酶的辅助因子。 张晓静 2009.09 酶活力测定法 一、酶活力 二、酶活力的测定 张晓静 2009.09 一、酶活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大，酶活力越高，反之越低。 酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测定产物的增加量为准。 酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。 1.概念 张晓静 2009.09 一、酶活力 酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示,即酶单位(activity unit，U)。 酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。同一种酶往往有几种不同的单位。 例如，1IU＝lμmol/min；1Kat = 1mol/s 2.酶活力单位 张晓静 2009.09 一、酶活力 酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等，只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。 测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大，测定底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速率，这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能比较可靠地反映酶的含量。 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 酶活力 的测定步骤 ① 底物 ② 反应条件 ③ 反应时间 ④ 底物或产物 变化量 选择底物 配制底物溶液 确定酶促反应条件：pH、温度等 准确计时并终止反应 运用各种检测技术，快速、简便、准确的测定变化量 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 ①底物：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可预先配制后置冰箱保存备用。 ②反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、pH等条件。温度可选在室温(25℃)、体温(37℃)、酶促反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进行。pH应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定pH的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其他条件，应适量添加。 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 ④底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物增加量或底物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量采用快速、简便、准确的方法测出结果。 ③反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用：加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 2.酶活力的测定方法 测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法、化学检测法等生化检测技术。 一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况选用。 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 1.分光光度法 2.荧光法 酶 活 力 的 测 定 方 法 3.同位素测定法 4.电化学方法 5.其他方法 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 1.分光光度法 分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都可以用此法测定。 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这种方法称为酶偶联测定法。 张晓静 2009.09 二、酶活力的测定 2.荧光法 荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测定。由于荧光方法的灵敏度往