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实时荧光定量PCR技术培训;（一）实时荧光定量PCR原理和应用;PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用; 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。 ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引 物 和 模 板 Ｄ Ｎ Ａ 结 合 的 特 异 性 。 反 应 分 三 步 ： ① 变 性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。;定量 PCR 技术（real-time PCR），是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。; 荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法，;SYBR Green I 的优点： 实验设计简单，仅需要设计上下游一对引物，不需 要设计探针，无需设计多个探针即可快速检验多个基因，通用性好；成本低；能 够通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。因而在低通量实验和单重实验时一 般优先考虑使用 SYBR Green I 染料法。 SYBR Green I 的缺点：由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合， 因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量 的精确性，SYBR Green I 方法对 PCR 扩增特异性要求较高。实验过程中通过熔 解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。另外， 因为 SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反 应。 ; 实验技术路线图;（二）实时荧光定量PCR实验设计;实验要素;样品;标准品; 标准品制作流程;梯度稀释方法;引物;好的引物;优化步骤;扩增效率;阴性对照：基因组对照;看家基因的选择标准;重复;实验中考虑因素;避免污染;（三）实时荧光定量PCR实验结果分析;1）绝对定量：测定未知样品的绝对量，??给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量； 2）相对定量：未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA 改变了多少倍。 绝对定量是通过样品的 Ct 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总 RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。 相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品 A）和对照组（样品 B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。;绝对定量与相对定量;绝对定量：标准品;相对定量;相对定量数据处理;相对定量：双标准曲线法;Thanks for your attention