2011核酸体外扩增.ppt

六. 结果观察 琼脂糖凝胶电泳试验 浓度：0.8-1.5 %（Agarose ） 缓冲液 ：1 ×TAE 指示剂：EB（溴化乙锭） （四）PCR反应的特点 特异性强：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键； 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg)量级的起始待测模板扩增到微克(?g)水平； 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 4.对标本的纯度要求低： 　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 5）用途广泛 生命科学 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学 （五）、PCR中应注意的事项 PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异扩增带 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 注意的事项： (六) 其它PCR方法 不对称PCR (asymmetric PCR) 区别: 用不等量的一对引物，这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，(比例一般为50～100∶1) 结果: PCR扩增后产生大量的单链DNA (ssDNA), 在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA. 高浓度引物 低浓度引物 不对称PCR的关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例. 还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定.? 逆转录-PCR (RT-PCR, Reverse Transcription -Polymerase Chain Reaction)  原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增， 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 RT-PCR实验应注意事项1．在实验过程中要防止RNA的降解，避免mRNA的断裂以保持RNA的完整性。 2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有 GAPDH、β-Actin等。 ??? RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，因此让一些极微量RNA样品分析成为可能。 作用：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针等。 GAPDH 目的基因 4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5． 防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品，PCR引物置于基因的不同外显子 原位PCR技术(In Situ PCR ) 　原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是组织切片、细胞涂片或爬片。 其基本方法为①固定组织或细胞:用多聚甲醛处理 ②蛋白酶K消化处理:用蛋白酶K55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K. ③PCR扩增:在组织细胞切片上，加PCR反应液，放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交. ⑤显微镜观察结果. 　　 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理、临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.? 原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。 多重PCR 　　多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同. 多重PCR的用途主要有两方面: 1.多种病原微生物的同时检测或鉴定： 在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增. 组合方式: ①肝炎病毒感染的鉴定，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒