荧光光谱 FLPPT.pptVIP

* * 仪 器 分 析 Instrumental Analysis 分子发光光谱法Molecular Luminesence Spectrumetry 分子荧光: Fluorescence; 分子磷光:Phosphorescence 主要和常用的荧光磷光分光光度计及型号 HITACHI（日立）F-4500 荧光分光光度计 荧光/磷光/发光分光光度计(PerkinElmer) LS-55 § 1 分子发光的基本原理 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。 一. 分子荧光与磷光的产生 1. 单重态与三重态 （p79） 2. 分子的活化与去活化 3.分子发光的类型 按激发的模式分类： 按分子激发态的类型分类： 光致发光 化学发光/生物发光 热致发光 场致发光 摩擦发光 分子发光 分子发光 荧光 磷光 瞬时荧光 迟滞荧光 按光子能量分类： 斯托克斯荧光(Stokes)： λex λem 反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex λem 共振荧光(Resonance)： λex = λem 荧光 分子的活化与去活化 (p78) S0 S1 T1 S2 紫外可见吸收 光谱 外转移 紫外可见共振荧光 光谱 内转移 荧光 系间窜跃 磷光 反系间窜跃 迟滞荧光 振动弛豫 ２. 无辐射跃迁的类型 振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁回到基态 内 转 移:S2~S1能级之间有重叠 系间跨跃: S2~T1能级之间有重叠 反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 ~ S2 １. 辐射跃迁的类型 共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec 2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 蒽的激发光谱 固定发射波长、扫描激发波长 I F ∝f (λex 、λem) 蒽的发射光谱 固定激发波长、扫描发射波长 蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱 VB1和VB2的三维荧光光谱 ?ex =290nm (MAX) 固定?em=620nm(MAX) 固定?ex=290nm (MAX) ?em= 620nm(MAX) 2. 激发光谱与发射光谱的镜像关系 S0 4 3 2 1 S1 4 3 2 1 1. 发射光谱的形状与激发波长无关 分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。 1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→1 1 → 1 1 → 2 1 → 3 1 → 4 三、 荧光(磷光)光谱的特征 (p81) 3. 斯托克斯位移 对于稀溶液，当? bc0.05（磷光? bc0.01）时： IF----荧光强度 ?F-----荧光量子产率 k--与仪器灵敏度有关的参数 I0--入射光强度。 IP----磷光强度 ?P-----磷光量子产率 b--吸收光程 ?--摩尔吸光系数 C--荧光物质浓度 四. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系 1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系 光吸收定律（Lambert – Beer Law） 2. 荧光(磷光)的平均寿命 分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/2所经历的时间。 It = I0e-t/T lnIt-t作图得一直线，又斜率可以求得荧光寿命的数值。 利用荧光寿命可以进行荧光化合物分析。 3. 荧光(磷光)的量子产率 荧光量子产率的定义： (p91) kF、 kp主要取决与荧光物质的分子结构； ?st系间窜跃效率。 ? ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。 大多数的荧光物质的量子产率在0