荧光,DNA染色实验2011.pptVIP

凋亡细胞的荧光标记形态观察 目的： 观察细胞核形态，判别凋亡细胞。 原理： DNA荧光染料Hoechst33258能透过完好细胞膜进入核内，凋亡细胞染色质致密，常呈月牙形斑块或碎裂，并可见凋亡小体。非凋亡细胞核染色较均匀，荧光较淡，死亡细胞不染色。 用品： 培养肺癌细胞(A549)  荧光染料Hoechst33258  PBS (无Ca++ 、 Mg++)，PH 7.2 4%甲醛，PBS配制； 荧光显微镜 步骤 1、细胞培养于带盖玻片的培养皿中，制备单层培养细胞。给予不同处理，处理结束后，弃培养液，PBS洗2次； 2、 4%甲醛固定10分钟后，PBS洗1次 3、以5~10ug/mI Hoechst33258染色约5分钟，自来水冲洗； 4、取出盖玻片，细胞面向下倒扣于载玻片上，荧光显微镜下观察。 结果 凋亡细胞核呈强亮的蓝绿色荧光，活细胞的核仅呈弱荧光，死细胞一般不被Hoechst332染色。 正常细胞 凋亡细胞 细胞核Hoechst33258荧光染色 Feulgen染色法 目的：观察细胞中的DNA 原理：细胞中的DNA在60℃用1M HCl 解离脱氧核糖核酸，使嘌呤碱与糖苷键打开，嘌呤碱脱去，脱氧核糖中的醛基游离；醛基能与Schiff试剂相结合，形成一种紫红色的复合物。 用品： 1M HCl Schiff试剂 漂洗液（现用现配）： 10%亚硫酸钠溶液 10 ml 蒸馏水 200ml 1M HCl 10ml Carnoy固定液： 纯酒精 : 氯仿 : 冰醋酸 = 6 : 3 : 1 步骤： 1. 细胞培养于带盖玻片的培养皿中，制备单层培养细胞。弃培养液，PBS洗1次，固定 15分钟，PBS洗1次； 2. 取出盖玻片， 置于玻片架上（注意细胞面方向），置于1M HCl中作用 1~2分钟（室温）； 3. 移至60℃水浴中， 1M HCl孵育10分钟； 4. 移回冷1M HCl 1分钟； 5. 将盖玻片取出，置于培养皿盖中，加入Schiff试剂染色作用1小时（室温）； 6.漂洗液洗2次； 7.蒸馏水漂洗2次； 8.上行梯度酒精脱水; 9.二甲苯透明; 10.树胶封片; 结果：镜下观察可见细胞核染成粉红色 至紫红色，可见分裂期的细胞。 Feulgen染色法显示DNA