10免疫组织化学检测技术PPT.pptVIP

第10讲;基本内容;一、定义;二、免疫组化的检测原理;二、免疫组化的检测原理; 两种免疫细胞化学反应方法;三、免疫组化的全过程;1、标本的处理 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 ;1、标本的处理 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞。 主要包括三部分： ①标本的固定与保存 ②制作切片 ③酶消化处理 ;①组织材料的固定目的: （1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 （2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。 ;①标本的固定与保存 固定时间： 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 ;①标本的固定与保存 好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应 ;三、免疫组化的全过程;冰冻 切片;③酶消化处理 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。;2、抗体处理与保存 抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应浅或不着色。 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。（效价指某一物质引起生物反应的功效单位 ）;3、免疫染色（关键步骤） 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； ;3、免疫染色 对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。 ⑴蛋白酶消化法 采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。 常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。 ;3、免疫染色 ⑵非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物树脂上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。 ;免疫组化染色中标识物的选择原则： 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定 ;常用标记物 ①荧光素： 最常用的是异硫一氰酸荧光素（荧光显微镜下呈绿色荧光） 四乙基罗达明（荧光显微镜下发橙红色荧光） ②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ⑤其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用） ;4、设立对照实验 为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。 （1）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 （2）阴性对照 用不含已知抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。 ;5、观察 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）。 ;三、免疫组化的全过程;三、免疫组化的全过程;荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 免疫标记电镜技术 …… ;免疫荧光技术将荧光素作为标记物，使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。 荧光素：作为染料在激发光照