2-2 免疫组织化学技术PPT.ppt

第四章、免疫组织化学技术;（二）冰冻切片免疫组化染色 1.恒冷箱切片：新鲜组织或－80℃保存 组织切片10-14um； 2.裱片和晾干,密封-20℃短期保存 ； 3.染色前冷丙酮4℃固定10-20分，PBS冲洗2次×5min； 4.必要时细胞膜打孔。 5.通常苏木精复染细胞核，水溶性封片剂封片。 (三)培养细胞免疫细胞化学染色 1.固定 贴壁细胞制备细胞爬片；悬浮细胞制备滴片或者甩片 4%多聚甲醛或冷丙酮室温固定10-20min 2.晾干 易脱片的细胞大于2h， PBS冲洗2次×5min； 3.细胞膜打孔 ;二、SABC法与免疫组织化学染色其它方法比较;三、免疫组织化学染色结果评价;（一）以抗原表达模式定位 1．细胞质内弥漫性分布，即胞质型阳性反应； 2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚。;5.细胞核阳性反应如BrdU及雌、孕激素受体蛋白等。 有些抗原的阳性表达也可同时出现在细胞的不同部位，如细胞质和细胞膜等。;(二) 阳性染色结果定量 1．计算免疫反应阳性细胞数 每个样品中10个非重叠视野；至少三个条件相同的样品；柱形图；;2．以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定 阴性 0~25个 ﹢ 25~50 ﹢ ﹢ 50~75 ﹢ ﹢ ﹢ ﹥75 3. 图像分析系统检测阳性结果（详见第七章） ;四、讨论;（二）抗体的稀释度 最佳抗体浓度可提高染色质量，与周围组织形成良好对比 表4-1.确定一抗的最佳工作浓度 一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性染色背景强度 1:50 十十十十 十十 1:100 十十十 十 1:200 十十 一 阴性对照 一 一 在一抗稀释度1:100和1:200之间可找出最佳稀释度。 抗体的种类（多、单克隆抗体；即用、浓缩抗体） 抗体的稀释液： 10mg/ml BSA和0.05 (v/v)% Tween 20 加入0.01molPBS 液 ;(三)滴加抗体注意事项 （组织切片、细胞培养） 吸掉多余液体；注意：避免碰到组织或细胞 避免干燥；注意：一次处理少数切片 滴加抗体在组织表面 免疫组化笔适用于培养细胞，注意：轻摇动数秒，使抗体分布均匀 ;（四）抗体的保存 1．抗体分装 浓??型-20℃冰箱保存 2．抗体稀释 用前涡旋混匀，4℃，1-2个月 3．无菌与消毒 与抗体接触的工具消毒 (五) 对照实验 非常重要 ;常用的对照组有以下几种：;四、替代对照用与一抗来源相同动物非免疫血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。 可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。 五、吸收试验对照用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。 六、自身对照 用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。 但进行科研工作中，单纯用这种对照是不科学的。必须增加如空白对照、替代对照等，才能使染色结果得到承认。; 对照实验方法和结果分析;(六)免疫组织化学技术应用的基本原则;应用的基本原则 确定细胞类型和形态 组织特异性蛋白 GFAP、NF 2．辨认细胞产物的来源 针对细胞产物的抗体 胰岛素 3．确定细胞的分化程度 不同时期的??志性蛋白 Nestin vimentin Tublin NF 4．追踪神经纤维束和它的投射区 轴质逆行运输 5. 在临床病理中的应用 如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后，辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。AFP;顺向示踪 皮质脊髓束（皮层注射）荧光红; 第三节 免疫组织化学双重染色; 2.与单染不同点： 在第一种抗原显色后，加双标阻断液或0.05%盐酸, RT，10min，避免已显色的抗原褪色。 滴加非免疫血清（与二抗同种属）37 ℃，10分钟。（不洗） 接着加入第二种一抗37 ℃孵育，30min或4 ℃过夜； 重复以前的步骤。（注意：二抗的种属性，复合物中酶不同） ;