第章同位素示踪在植物病理学研究中的应用教学教材.pptVIP

第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用; 第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用 §1 病原微生物的标记 1.1直接法 通过标记培养基而标记病原微生物的方法。将适合的放射性核素或其标记化合物,加入培养基,然后接种病原微生物, 通过培养使其摄取放射性而获得标记,该法仅限于非专性寄生微生物的标记。 ; 方法要点 培养基 适合的普通培养基。 标记核素 常用14C、32P、35S，如14C-葡萄糖，14C-蔗糖， 32P -KH2PO4。 放射性活度 MBq/ml的范围 为了避免刮取菌落时被放射性培养基粘污可用双层培养法。; 平板培养时，先在含放射性的培养基上接种培养，待菌落铺满后，再在上面铺上一层非放射性培养基，经过一段时间，菌絲将透过上层培养基，这样获得的标记菌落，可避免放射性培养基污染。 ; 1.2 间接法 对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应 先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标 记。 1）寄主植物 先标记后接种，用一般植物标记 法进行标记，干组织应具有0.37 ?104 3.7 ?104 Bq/ml。 2）寄主真菌 如以真菌为食料的线虫体,先培养 并标记交链孢霉菌,取得标记的孢霉菌后,在其体上接种线虫体进行标记。 ; 3）寄主细菌 通过标记细菌使其专性寄生噬菌体得到标记。先标记细菌， 洗去放射性粘污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，经培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几乎被吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯的标记噬菌体。 ; 1.3标记检测 制备的标记病原微生物可用于病原微生物与寄主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方面研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测定其浓度或比活度。 1）洗涤 一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。 2）测定 32P标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测量，14C-标记的真菌、线虫、细菌等病原生物，可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部位，可用相应制样法制备样品并测量。 ; § 2 病害侵染途经的研究 探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体进行空间取样检测或??行自显影，便可确定病菌的侵染途经、过程及规律。 2.1 土壤病害侵染途经 土传病害，主要由真菌或线虫引起。进行研究时，病原微生物常用直接拌土壤法,或制成菌液或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进,使其繁殖达到侵染的目的,然后定期对植珠取样进行放射测定或自显影,判明示踪菌的侵染途经及其在寄主中的分布。; 2.2种子传播病害途经 种子传播的病害也为数不少,如水稻白叶枯病,小麦黑粉病,棉花炭疽病。通常用侵种法标记病原生物,检测病原菌由种子侵入幼苗及其过程,以揭示侵染规律和发病机制,开花期侵染的病菌,可在花期于穗部微喷孢子悬浮液方法接种,接种后要套代保湿。 2.3 虫媒病害侵染途经 常用间接标记法,即先标记病原植物, 再接种昆虫使其吸取标记毒原而标记,然后将其接种于寄主,研究虫媒侵染过程。; 2.4 其它病害侵染途经 主要通过杂草, 空气与雨水等途经的传播。因为可能招致环境放射污染,使用受到限制,但在严格控制的条件下, 一些研究可能提供有价值的信息。禹王树（1986）在稻株接种14C白叶枯细菌，不但当年发病期在田边杂草能检测出放射性，而且次年15种杂草也能检出，表明水稻白叶枯病可以通过田边杂草传播病害。 ; §3 植物病害检测与诊断 植物病害诊断与植物检疫工作中，放射免疫分析以及后来发展起来的酶联吸附免疫分析（ELISA）法,因较传统的血清检验（琼脂糖平板）等方法要灵敏得多，可以检测已感染带毒而尚无症状的植物、定量检测病原菌侵染的数量或产生的代谢毒素，因此被作为病害初期诊断与预报及检疫的重要手段，用于作为进一步进行其它研究的基础。 ; 3.1检测的一般程序; 使寄主组织软腐坏死，利用寄主的蛋白和核酸合成系统进行自身繁殖，多数病毒属于此类；分泌毒素破坏寄主正常代谢；分泌阻塞寄主导管的物质，致使其枯萎；产生植物激素，破坏寄主的激素平衡。而植物的诱导抗病性则是由植物抗病基因与病原无毒基因相互识别后，诱导的防卫反应决定的。寄主可以通过多种方式抵御病原侵染，如加固细胞进行屏蔽，合成植保素，诱导各种病程相关蛋白等 。 ; 在植物各个病理反应阶段的研究，可以使用的示踪相关技术如下： 4.1显微免疫定位 利用放射性显影或荧光显像技术，对病源微生物或其激发子等配体的特异受体进行组织、细胞或分子水平的定位。方法是对配体进行放射性或荧光标记，经体内引入或体